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Probenvorbereitung

 

Der Nutzer ist für die adäquate Vorbereitung (incl. Färbung) der zu sortierenden Zellen sowie für die entsprechenden Kontrollfärbungen verantwortlich. Wir sind ihnen jedoch gerne bei der Planung von Experimenten behilflich.

  • Alle Zellen müssen vor der Sortierung durch ein Nylonsieb filtriert werden (40µm für Sortierung über 70µm Nozzle, 70µm für Sortierung über 100µm Nozzle). Für Zellen, die zu Aggregatbildung neigen, kann es vorteilhaft sein, sie in einem EDTA-haltigen Puffer aufzunehmen (z.B. PBS, Ca/Mg-frei, 0,5% BSA und 1-2mM EDTA). In der Regel ist es am besten, die Zellen bis zur Sortierung auf Eis und vor Licht geschützt stehen zu lassen.
  • In Proben mit einem hohen Anteil toter Zellen kann freie DNA zum Verklumpen von Zellen führen. Hier empfiehlt es sich 10 U/ml DNAse mit 1-5 mM MgCl zuzugeben. Achtung: DNAse nicht in EDTA-haltigem Puffer verwenden!
  • Die Konzentration der Zellen für die Zellsortierung sollte in Abhängigkeit von Zellzahl, Zellgröße und der Tendenz der Zellen zu aggregieren zwischen

    • 5 x 106 Zellen pro ml (z.B. große, adhärente Zellen) und
    • 50 x 106 Zellen pro ml (z.B. Lymphozyten) liegen

    Das Ausgangsvolumen sollte allerdings 250 µl nicht unterschreiten.
  • Die Zellsuspension für die Sortierung kann in 1,5 ml Eppendorf-Cups, 5 ml (12x75 mm) Tubes, oder 15 ml Tubes vorliegen (für MoFlo und MoFlo XDP zusätzlich 50 ml Tubes).
    • Es wird dringend empfohlen, wegen der unterschiedlichen elektrostatischen Eigenschaften Probenröhrchen aus Polystyren (klar) und Auffanggefäße aus Polypropylen (trüb) zu verwenden.
    • Für die sortierten Zellen sollten Auffangröhrchen mit einem geeigneten Medium vorbereitet werden, z.B.
            - fötales Kälberserum
            - eigenes Zellkulturmedium mit Antibiotika
            - PBS

      Hinweis: Eine aussagekräftige Reanalyse der sortierten Zellen ist nur bei Verwendung von filtriertem (0,2 µm) Auffangmedium möglich (insbesondere bei FCS-haltigen Medien).

    • Da die Zellen durch den Sortiervorgang erheblich gestresst werden und das Medium durch die sortierten PBS-Tropfen verdünnt wird, sollte die Serum-/Proteinkonzentration bei empfindlichen Zellen höher als die bei der Kultur verwendete Standardkonzentration liegen (Verdünnung durch PBS beim Sortieren mit 70 µm Nozzle ca. 1 nl pro sortierter Zelle, bei 100 µm Nozzle ca. 3 nl pro sortierter Zelle).
    • Als Auffanggefäße können 1,5 ml Eppendorf-Cups, 5 ml (12x75 mm) Tubes und 15 ml Tubes (nicht für mehr als zwei Populationen gleichzeitig!), sowie Zellkulturplatten (6 - 384 Wells) dienen.

      Achtung: Für Sortierungen von infektiösen Proben bzw. Proben der gentechnischen Sicherheitsstufe S2 sind als Auffanggefäße ausschließlich 5 ml und 15 ml Tubes möglich.