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Spezielle Methoden und Projekte

 

  • Spezielle Methoden und Projekte
  • Array-CGH

    Array-CGH

     

    Anprechpartner: Prof. Dr. rer. nat. Doris Steinemann

     

     

    Bei der Array-CGH handelt es sich um eine molekulare Analyse des gesamten Genoms (Mensch, Maus, u.a.), mit der sehr kleine chromosomale Veränderungen (Mikrodeletionen und Mikroduplikationen, allerdings keine balancierten Chromosomenaberrationen) nachgewiesen werden können.

     

     

    Vorteile der Array-CGH

     

    Die hochauflösende Array-CGH-Analyse ist etwa 200mal sensitiver als die  herkömmliche mikroskopische Chromosomenanalyse. Sie erreicht - abhängig vom verwendeten Array - eine Auflösung von ungefähr 50 Kilobasen. Die herkömmliche  Identifikation struktureller Chromosomenaberrationen liegt oberhalb einer Größe von ca. 5-10 Millionen Basenpaaren.

     

     

    Prinzip

     

    Das Prinzip beruht auf einer Hybridisierung farblich markierter DNA an ein Raster von immobilisierten DNA-Fragmenten (Array), die bestimmten chromosomalen Regionen im Genom entsprechen.

    Patienten (Probe) und Referenz DNA werden unterschiedlich markiert und gemeinsam auf den Array hybridisiert. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten jeder einzelnen Sonde gibt Aufschluss über die Kopienzahl der entsprechenden DNA. Die Regionen, wo die Testperson im Vergleich zur Kontrolle eine Deletion trägt, also ein Stück fehlt, leuchten später grün auf, die, wo ein Stück zuviel vorliegt (Duplikation) leuchten rot auf (siehe Abbildung).

     

     

     

    Auswertung und Interpretation
     

    Datenbankenrecherchen spielen eine große Rolle bei der Auswertung und Interpretation der Daten hinsichtlich der Lokalisation und Funktion der

     

     

     

     

    Einsatzbereiche der Array-CGH
     

    Die Array-CGH kommt als spezielle Untersuchungsmethode in verschiedenen Bereichen zum Einsatz. Dazu gehören: 

    • Postnatale Diagnostik
    • Tumorgenetik
    • Maus-Modelle
    • genomische Integrität von IPSCs

     

    In der postnatalen Diagnostik dient die Array-CGH zur Diagnostik von Entwicklungsverzögerungen und Fehlbildungssyndromen. Submikroskopische Microdeletionen und Microduplikationen sind häufige Ursache für syndromale Erkrankungen, die meist mit Fehlbildungen und mentaler Retardierung einhergehen. Die Detektionsrate chromosomaler Aberrationen wurde mit dieser hochauflösenden Technologie deutlich verbessert. (1)
      

    In der Tumorgenetik kommt die Array-CGH bei der Identifizierung wiederkehrender chromosomaler Veränderungen in bestimmten Gruppen von Tumoren (Tumorklassifizierung) zum Einsatz. Gene aus solchen Regionen spielen bei der Tumorentstehung und -entwicklung möglicherweise eine wichtige Rolle. Da chromosomale Veränderungen in vielen Tumoren, insbesondere Leukämien, klinische Relevanz haben, sind sie auch bedeutend im Hinblick auf die Stratifizierung und der Abschätzung der Prognose. (2-5)
      

    In verschiedenen Maus-Modellen dient die Array-CGH zur Charakterisierung von Tumoren, beispielsweise nach retroviralem Gentransfer: Der Transfer von Vektoren, die stabil in das Zielgenom integrieren, ermöglicht die Korrektur eines defekten Gens. Allerdings birgt jede Integration in ein zelluläres Genom die Gefahr, Protoonkogene zu aktivieren und eine Leukämie zu induzieren. Mittels Array-CGH werden die so entstandenen Leukämien molekular untersucht, um beispielsweise Gene, die zur Leukämieentstehung beitragen, zu identifizieren.(6-8)
      

    Die Array-CGH wird auch zur Kontrolle der genomischen Integrität von iPSCs eingesetzt, da sich herausgestellt hat, dass mit der Reprogrammierung eine erhöhte genetische Instabilität verbunden sein kann. 
     
    Wir bieten die Methode daher für alle Forschungsgruppen an, die das Auftreten klonaler Chromosomenaberrationen überwachen möchten. (9-12)
      

     

    Literatur

    (1)  Gadzicki D, Baumer A, Wey E, Happel CM, Rudolph C, Tonnies H, Neitzel H, Steinemann D, Welte K, Klein C, Schlegelberger B. Jacobsen syndrome and Beckwith-Wiedemann syndrome caused by a parental pericentric inversion inv(11)(p15q24). Ann Hum Genet 2006; 70(Pt 6):958-964.
     
    (2)  Tauscher M, Praulich I, Steinemann D. Array-CGH in childhood MDS. Methods Mol Biol 2013; 973:267-278.
     
    (3)  Ripperger T, Tauscher M, Praulich I, Pabst B, Teigler-Schlegel A, Yeoh A, Gohring G, Schlegelberger B, Flotho C, Niemeyer CM, Steinemann D. Constitutional trisomy 8p11.21-q11.21 mosaicism: a germline alteration predisposing to myeloid leukaemia. Br J Haematol 2011; 155(2):209-217.
     
    (4)  Praulich I, Tauscher M, Gohring G, Glaser S, Hofmann W, Feurstein S, Flotho C, Lichter P, Niemeyer CM, Schlegelberger B, Steinemann D. Clonal heterogeneity in childhood myelodysplastic syndromes--challenge for the detection of chromosomal imbalances by array-CGH. Genes Chromosomes Cancer 2010; 49(10):885-900.
     
    (5)  Steinemann D, Skawran B, Becker T, Tauscher M, Weigmann A, Wingen L, Tauscher S, Hinrichsen T, Hertz S, Flemming P, Flik J, Wiese B, Kreipe H, Lichter P, Schlegelberger B, Wilkens L. Assessment of differentiation and progression of hepatic tumors using array-based comparative genomic hybridization. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4(10):1283-1291.
     
    (6)  Kustikova OS, Schwarzer A, Stahlhut M, Brugman MH, Neumann T, Yang M, Li Z, Schambach A, Heinz N, Gerdes S, Roeder I, Ha TC, Steinemann D, Schlegelberger B, Baum C. Activation of Evi1 inhibits cell cycle progression and differentiation of hematopoietic progenitor cells. Leukemia 2013; 27(5):1127-1138.
     
    (7)  Manukjan G, Tauscher M, Ripperger T, Schwarzer A, Schlegelberger B, Steinemann D. Induced G1 phase arrest of fast-dividing cells improves the quality of genomic profiles generated by array-CGH. Biotechniques 2012; 53(4):245-248.
     
    (8)  Heckl D, Schwarzer A, Haemmerle R, Steinemann D, Rudolph C, Skawran B, Knoess S, Krause J, Li Z, Schlegelberger B, Baum C, Modlich U. Lentiviral vector induced insertional haploinsufficiency of Ebf1 causes murine leukemia. Mol Ther 2012; 20(6):1187-1195.
     
    (9)  Steinemann D, Gohring G, Schlegelberger B. Genetic instability of modified stem cells - a first step towards malignant transformation? Am J Stem Cells 2013; 2(1):39-51.
     
    (10)  Didie M, Christalla P, Rubart M, Muppala V, Doker S, Unsold B, El Armouche A, Rau T, Eschenhagen T, Schwoerer AP, Ehmke H, Schumacher U, Fuchs S, Lange C, Becker A, Tao W, Scherschel JA, Soonpaa MH, Yang T, Lin Q, Zenke M, Han DW, Scholer HR, Rudolph C, Steinemann D, Schlegelberger B, Kattman S, Witty A, Keller G, Field LJ, Zimmermann WH. Parthenogenetic stem cells for tissue-engineered heart repair. J Clin Invest 2013; 123(3):1285-1298.
     
    (11)  Grabundzija I, Wang J, Sebe A, Erdei Z, Kajdi R, Devaraj A, Steinemann D, Szuhai K, Stein U, Cantz T, Schambach A, Baum C, Izsvak Z, Sarkadi B, Ivics Z. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res 2013; 41(3):1829-1847.
     
    (12)  Wu G, Liu N, Rittelmeyer I, Sharma AD, Sgodda M, Zaehres H, Bleidissel M, Greber B, Gentile L, Han DW, Rudolph C, Steinemann D, Schambach A, Ott M, Scholer HR, Cantz T. Generation of healthy mice from gene-corrected disease-specific induced pluripotent stem cells. PLoS Biol 2011; 9(7):e1001099.

     

     

  • Gene expression arrays

    Gene expression arrays

     

    Anprechpartner: Dr. rer. nat. Britta Skawran

     

     

    Globale Genexpressionsanalysen

     

    Der Untersuchungsgegenstand von Genexpressionsanalysen ist das Transkriptom. Es umfasst alle RNAs, die durch die Transkription von Genen entstanden sind. Als "Mittler" zwischen Genom und Proteom stellt es somit die entscheidenden Weichen für die Herstellung eines Proteins. Außerdem gibt es zahlreiche RNAs, z.B. Mikro-RNAs, die Aufgaben in der Regulation von zellulären Prozessen übernehmen.


    Untersuchungen der Genexpression sind daher wichtig für das Verständnis physiologischer und pathologischer Prozesse.



     

    Prinzip
     
    Genexpressionsanalysen mit der DNA-Microarray-Plattform von Agilent erlauben eine zuverlässige Detektion von mehr als 41.000 Genen und Transkripten.
    Für die Durchführung wird zunächst aus Gewebe oder Zellen die gesamte RNA gewonnen und mit dem Agilent Bioanalyzer 2100 in ihrer Qualität überprüft. Dann wird die RNA in cDNA umgeschrieben und wegen der zu erwartenden nur geringen Mengen amplifiziert. Die cDNA wird dann wiederum in eine fluoreszenzmarkierte RNA umgeschrieben und auf einem Microarray hybridisiert. Auf einem Microarray befinden sich synthetisch hergestellte Oligonukleotide. Die Oligonukleotide dienen als Sonden, an die die markierten RNAs bei der Hybridisierung binden können. Nach der Hybridisierung wird das Fluoreszenzsignal jeder Position des Microarrays mittels eines Scanners nach Anregung durch einen Laser ausgelesen. Die Auswertung der Signale gibt Aufschluss über die Genexpression in der untersuchten Probe.

    An wen richtet sich das Angebot?

     

    In Kooperation können zu Fragestellungen aus der Tumorgenetik und zur Charakterisierung von Tumoren in verschiedenen Maus-Modellen Genexpressionsanalysen durchgeführt werden, um die Aktivität und Expression tausender Gene gleichzeitig gemessen werden, was einen Einblick in zelluläre Funktionen ermöglicht.

     

     

    Literatur

     

    Kompisch KM, Lange C, Steinemann D, Skawran B, Schlegelberger B, Müller R, Schumacher U. (2010)
    Neurogenic transdifferentiation of human adipose-derived stem cells? A critical protocol reevaluation with special emphasis on cell proliferation and cell cycle alterations.
    Histochem Cell Biol. 134:453-68.
     
    Skawran B, Dierich M, Steinemann D, Hohlfeld J, Haverich A, Schlegelberger B, Welte T, von Neuhoff N. (2009)
    Bronchial epithelial cells as a new source for differential transcriptome analysis after lung transplantation.
    Eur J Cardiothorac Surg. 36:715-21
     
    Skawran B, Steinemann D, Becker T, Buurman R, Flik J, Wiese B, Flemming P, Kreipe H, Schlegelberger B, Wilkens L. (2008) 
    Loss of 13q is associated with genes involved in cell cycle and proliferation in dedifferentiated hepatocellular carcinoma.
    Mod Pathol. 21:1479-89.
     
    Bertram C, von Neuhoff N, Skawran B, Steinemann D, Schlegelberger B, Hass R. (2008)
    The differentiation/retrodifferentiation program of human U937 leukemia cells is accompanied by changes of VCP/p97.
    BMC Cell Biol. 9:12.
     
    Skawran B, Steinemann D, Weigmann A, Flemming P, Becker T, Flik J, Kreipe H, Schlegelberger B, Wilkens L. (2008)
    Gene expression profiling in hepatocellular carcinoma: Upregulation of genes in amplified chromosome regions.
    Mod Pathol 21:505-16.

  • 24-Farben FISH (mFISH)

    24-Farben FISH (mFISH)

     

    Anprechpartner: Prof. Dr. med. Gudrun Göhring

     

     

     

    24-Farben Fluoreszenz in situ Hybridisierung

    Die 24-Farben Fluoreszenz in situ Hybridisierung (24-Farben-FISH) wird in Ergänzung zur klassischen Bandendarstellung durchgeführt. Um fragliche Chromosomenaberrationen näher zu bestimmen sowie zur Identifizierung möglicher kryptischer Aberrationen wird diese Methode eingesetzt.

     

     

     Karyogramm eines Patienten mit myelodysplastischem Syndrom und komplex aberrantem Karyotyp (4)

     

     

    Literatur

    Gohring G, Lange K, Atta J, Krauter J, Holzer D, Schlegelberger B.
    Cryptic t(15;17) in a patient with AML M3 and a complex karyotype.
    Cancer Genet.Cytogenet. 2007 Mai;175(1):77-80.
     
    Gohring G, Karow A, Steinemann D, Wilkens L, Lichter P, Zeidler C, u. a.
    Chromosomal aberrations in congenital bone marrow failure disorders--an early indicator for leukemogenesis?
    Ann.Hematol. 2007 Okt;86(10):733-739.
     
    Gohring G, Erlacher M, van Buiren M, Juttner E, Niemeyer C, Schlegelberger B.
    Mesenteric chloroma with t(16;16) followed by acute myelomonocytic leukemia with clonal evolution.
    Cancer Genet.Cytogenet. 2007 Dez;179(2):162-164.
      
    Jädersten M, Saft L, Pellagatti A, Göhring G, Wainscoat JS, Boultwood J, u. a.
    Clonal heterogeneity in the 5q- syndrome: p53 expressing progenitors prevail during lenalidomide treatment and expand at disease progression.
    Haematologica. 2009 Dez;94(12):1762-1766.
      
    Lange K, Gadzicki D, Schlegelberger B, Göhring G.
    Recurrent involvement of heterochromatic regions in multiple myeloma--A multicolor FISH study. Leukemia Research [Internet].  [zitiert 2010 Feb 19]
    In Press, Corrected Proof. Available from: www.sciencedirect.com/science/article/B6T98-4Y05429-1/2/d333b34687cd65d0618d78b42e00bd83
     
    Gohring G, Schlegelberger B, Hellstrom-Lindberg E.
    Myelodysplastic syndromes. Molecular Diagnostics in Hematologic Oncology.
    Uni-Med Verlag Ag, 2008

  • Telomerlängenmessung

    Telomerlängenmessung

     

    Anprechpartner: Prof. Dr. med. Gudrun Göhring

     

     

     

    Telomere stellen die Chromosomenenden dar und bestehen aus einer repetitiven DNA-Sequenz (TTAGGG). Die Aufgabe der Telomere besteht in einer Schutzfunktion der Chromosomen. Durch das sogenannte Enden-Replikationsproblem verkürzen sich die Telomere mit jeder Zellteilung. Bei Erreichen einer kritischen Länge unterliegt die Zelle im Normalfall der Apoptose. Die Telomerlängenverkürzung sowie die chromosomale Instabilität spielen eine wichtige Rolle Im Rahmen der Leukämogenese. Die Telomerlängenmessung wird mittels der neu etablierten Methode Telomer/Zentromer-Fluoreszenz in-situ Hybridisierung (T/C-FISH) in Kombination mit R-Bandenanalyse durchgeführt. Mit Hilfe dieser Methode können nicht nur die Telomerlängen der Zellen im Mittel sondern auch die Telomerlängen einzelner Chromosomenarme gemessen werden. Für diese Methode werden Metaphasen aus heparinisiertem Material benötigt. Eine weitere Methode zur Telomerlängenmessung basierend auf einer RT-PCR wurde ebenfalls in unserem Institut etabliert.

     

     

             

               

    Metaphase nach Fluoreszenz- R-Bandendarstellung und nach T/C-FISH

     

     

     

             

               

       

    a) Darstellung eines Neotelomerclusters in Chromosom 1 nach T/C-FISH-Analyse einer Patientin mit myelodysplastischem Syndrom.

    b) und c) Karyogram der Patientin nach Fluoreszenz-R-Bandendarstellung

    (b) und nach 24-Farben-FISH Analyse (c)

     

     

    Literatur

    Lange K, Holm L, Vang Nielsen K, Hahn A, Hofmann W, Kreipe H, u. a.
    Telomere shortening and chromosomal instability in myelodysplastic syndromes.
    Genes Chromosomes Cancer. 2010 März;49(3):260-269.
     
    Cawthon RM.
    Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method.
    Nucleic Acids Res. 2009 Feb;37(3):e21.

  • ERN PaedCan

  • Orphanet

     

    Koordination Orphanet Deutschland: Dr. med. Susanne Morlot

     

     

     

      - das Portal für seltene Krankheiten und Orphan Drugs

     

    Orphanet ist eine einzigartige Ressource, die das Ziel verfolgt, das Wissen um seltene Krankheiten zu sammeln und zu erweitern, um so die Diagnose, Versorgung und Behandlung von Patienten mit seltenen Krankheiten zu verbessern. Orphanet stellt hochwertige Informationen über seltene Krankheiten zur Verfügung und gewährt gleichberechtigten Zugriff auf diese Informationen für alle Interessengruppen. Orphanet pflegt darüber hinaus die Orphanet-Nomenklatur der seltenen Krankheiten (ORPHA code), die wesentlich zur Verbesserung der Sichtbarkeit von seltenen Krankheiten in Informationssystemen von Gesundheits- und Forschungseinrichtungen beiträgt.

     

    Orphanet wurde im Jahr 1997 in Frankreich von INSERM (Französisches nationales Institut für Gesundheit und medizinische Forschung) etabliert. Die Initiative wandelte sich im Jahr 2000 in ein europaweites Anliegen und wird seitdem durch Fördermittel der Europäischen Kommission unterstützt: Orphanet besteht heute aus einem Konsortium von 40 Partnerländern aus Europa und weiteren Mitgliedern rund um den Globus.

     

    (Quelle: Orpha.net)

     

     

     

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    (Quelle: Orpha.net/National/DE)

     

     

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