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Forschungsbericht 2008

Forschungsberichte 2008 , 2009 , 2010 , 2011 , 2012 , 2013 , 2014 , 2015 , 2016


I  Forschungsprofil der Abteilung

 

Das wissenschaftliche Hauptinteresse der Abteilung gilt den molekularen Funktionsprinzipien, die es den verschiedenen Motorproteinen erlaubt, unter Hydrolyse von ATP Kräfte und Bewegungen zu erzeugen. Mit diesen Kräften und Bewegungen sind Motorproteine praktisch für alle Formen von Bewegungen in der belebten Welt verantwortlich, z.B. verschiedenen Formen der Fortbewegung, Formänderungen von Zellen oder intrazellulären Transportprozessen. Entsprechend ihrer vielfältigen Funktionen haben  sich drei große Familien von Motorproteinen entwickelt, die Myosine, die mit Aktinfilamenten interagieren, sowie die Kinesine und Dyneine, die Kräfte und Bewegungen im Zusammenspiel mit Mikrotubuli erzeugen. Motorproteine agieren entweder als individuelle Moleküle, wie z.B. bei intrazellulären Transportprozessen, oder sie sind in komplexen Strukturen wie Myofibrillen oder Flagellen organisiert.
Die Bedeutung der Motorproteine ist besonders an einer Vielzahl von  Erkrankungen zu erkennen, die auf Mutationen in Motorproteinen oder auf Veränderungen modulierender Proteine zurückzuführen sind. Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie, Tumorentstehung, degenerative Erkrankungen der Motoneurone oder die Alzheimer-Demenz sind Beispiele solcher Erkrankungen.



Ziel unserer Forschungsprojekte ist einerseits zur Aufklärung der molekularen Funktionsprinzipien der Motorproteine beizutragen. Zum anderen wollen wir aufklären, wie Mutationen in Motorproteinen, z.B. in der Motordomäne des kardialen Myosins, über veränderte Funktion zu o.g. Krankheitsbildern, z.B. der familiären hypertrophischen Kardiomyopathie führen können. Darüber hinaus geben die primären funktionellen Auswirkungen solcher Mutationen Hinweise auf die funktionelle Bedeutung einzelner Strukturelemente der Motorproteine. Durch gezielte Veränderung dieser Strukturelemente und Expression der Konstrukte in geeigneten nicht-muskulären Systemen, z.B. E. coli, Dictyostelium discoideum oder Insektenzellen, kann die funktionelle Relevanz der einzelnen Strukturelemente systematisch aufgeklärt werden. Andererseits können aus den primären funktionellen Auswirkungen angeborener Mutationen Ansatzpunkte für korrigierende pharmakologische Beeinflussung der primären Funktionsstörungen und des resultierenden Krankheitsbildes identifiziert werden.



Die genannten Ziele erfordern ein breites Spektrum experimenteller Ansätze, angefangen bei vereinfachten zellulären Systeme wie Muskelfasern oder isolierte Herzmuskelzellen, deren Membranen durch Behandlung mit Detergenzien entfernt wurden, um direkten Zugang zu den kontraktilen Proteinen zu erreichen. Daneben kommen Untersuchungen an in vitro Assays zum Einsatz, die aus isolierten Proteinen rekonstituiert werden. Damit können auch nichtmuskuläre Myosine, Kinesine und Dyneine sowie in diese Proteine gezielt eingeführte Veränderungen nach Expression und Aufreinigung funktionell charakterisiert werden. Darüber hinaus können wir in solchen in vitro Assays auch am individuellen Einzelmolekül Kräfte und Schrittdistanzen messen und über Fluoreszenzsignale mit der Bindung bzw. Abdissoziation einzelner Substrat- und Produkt-Moleküle korrelieren.

Zum 1. April 2008 wurde mit Eintritt von Herrn Prof. G. Gros in den Ruhestand die Abteilung Vegetative Physiologie geschlossen. Noch laufende, DFG-finanzierte Drittmittelprojekte  werden unter Leitung von Herrn Gros in der Abteilung Molekular- und Zellphysiologie zu Ende geführt und sind unter 'Bereich Vegetative Physiologie' zusammengefasst.



Im Dezember 2008 hat Frau Prof. T. Kraft die W2-Schwerpunktprofessur "Physiologie" in der Molekular- und Zellphysiologie übernommen.


II Forschungsprojekte

 

Impact of tau protein on the function of the microtubule-based motor protein kinesin



ATP-driven molecular motors like myosin, dynein or kinesin generate motile forces of and within cells by interaction with cytoskeletal systems, either actin filaments or microtubules. For example, members of the microtubule-based kinesin super-family are motor proteins which are essential for many cellular processes like intracellular vesicle and organelle transport, chromosome motility, or assembly and function of the spindle. To fulfill their biological functions, kinesin molecules convert the chemical energy derived from ATP hydrolysis into unidirectional displacement along microtubules. In contrast to skeletal muscle myosin, conventional kinesin is a processive motor protein, i.e., it takes hundreds of 8 nm steps, the distance between two Alpha/Beta subunits of tubulin, before dissociating from its microtubule track. The ability of kinesin to travel long distances along microtubules without dissociating from its track is essential for its biological function as a motor for long-haul intracellular transport.



In cells kinesin molecules have to travel along microtubules which are abundantly decorated with microtubule associated proteins (MAPs) such as tau protein and others. MAPs bind to and organize microtubules and affect their stability. They can prevent or promote microtubule depolymerization, induce microtubule bundling or crosslink them to the actin network. In many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease (AD) or frontotemporal dementia and Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP17) tau protein is elevated, mislocalized and forms pathological aggregates, indicating the severe cellular consequences of tau misregulation. Since the tau binding site on the microtubule lattice overlaps with that for other proteins, e.g. the molecular motor kinesin, tau could also influence processes like axonal transport.

Mandelkow E, von Bergen M, Biernat J, Mandelkow EM., Brain Pathol. 2007 Jan;17(1):83-90.

Figure 1: (A) Bar diagram of the longest tau protein isoforms in the CNS, htau40. The two inserts in the N-terminal projection domain are shown in yellow, and the four repeats of the microtubule binding assembly domain are depicted in red. The flanking proline-rich domains are labeled with “P” (light blue). (B) Illustration of tau protein, modeled as a random chain, and the motor domain of kinesin-1 bound to a protofilament of a microtubule. Tau is natively unfolded and details of its structure are unknown (Mandelkow et al., 2007). (C) Illustration of a single molecule motility assay with an individual eGFP labeled kinesin molecule (blue crystal structure) moving on an immobilized microtubule (blue filament) in the presence of rhodamine labeled tau molecules (red).



To directly investigate the impact of tau protein on microtubule-based motility, we use a single molecule fluorescence approach showing both tau and tau aggregates on microtubules and movement of microtubule-based kinesin motors at the same time (Figure 1 C). We visualize individual fluorescently labeled kinesin and tau molecules by Total Internal Reflection Fluorescence microscopy (TIRFM) and measure average velocity, run length, and attachment frequency of kinesin molecules in the presence of tau protein. The average velocity of single kinesin molecules does not change with increasing tau concentration, whereas both run length and attachment frequency decrease.

In our experiments, we observed that tau was not stationary on microtubules but performed a diffusive walk on the microtubule lattice. Tau molecules can form aggregates temporarily, but can also dissociate and re-aggregate. Therefore, it is necessary to detect tau and kinesin molecules simultaneously because tau molecules are not stationary on microtubules, thus changing the position where they could act as road blocks for kinesin molecules. Movement of individual molecules can be displayed in a so-called kymograph.



Figure 2: 30 seconds kymographs of individual eGFP labeled kinesin molecules (green traces) moving on immobilized Cy5-labeled microtubules (not shown) in the presence of 1 mM ATP. Rhodamine labeled tau molecules were detected simultaneously (red traces). White arrow heads indicate detachment of kinesin molecules from the microtubule upon colocalization with tau protein.



In a kymograph, the positions of molecules along a line, e.g. a microtubule (horizontal axis in the kymograph) are plotted as a function of time (vertical axis). Immobile molecules appear as vertical lines while moving molecules deviate either to the left or right. Figures 2 A and B show two examples of 30 seconds kymographs of individual eGFP labeled kinesin molecules (green traces) moving on immobilized Cy5 labeled microtubules (not shown) in the presence of 1 mM ATP. Rhodamine labeled tau molecules were detected simultaneously (red traces). Most of the tau molecules were mobile on the microtubule. Kinesin molecules moved with an average velocity of ~730 nm/s.

With the described single molecule fluorescence approach using TIRF microscopy we will directly investigate the impact of different developmentally expressed tau isoforms and pathologically occurring tau mutants on microtubule-based kinesin motility.



Projektleiter: Scholz T, Mitarbeiter: Hinrichs M, Uta P; Kooperationen: Mandelkow EM, Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'


III Weitere Forschungsprojekte



(I) Molekulare Mechanismen zur Erzeugung von Kräften und Bewegungen im Skelettmuskel

Funktionelle und strukturelle Charakterisierung neuentdeckter Zwischenzustände der Myosinkopfdomäne (Querbrücke). Mechanische, kinetische, röntgenstruktur-analytische und elektronenmikroskopische Untersuchungen
Projektleiter: Brenner B, Kraft T; Mitarbeiter: Hodgkinson JL, Radocaj A, Lingk A, Piep B. Förderung: DFG ; HASYLAB, Deutsches Elektronensynchrotron, Hamburg.



Strukturumlagerungen in der Myosinkopfdomäne bei aktiver Kraftentwicklung und Verkürzung. Zeitaufgelöste 2D-Röntgenstrukturanalyse an isolierten Muskelfasern mittels Synchrotronstrahlung.
Projektleiter: Kraft T, Brenner B; Mitarbeiter: Radocaj A; Förderung: DFG



Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf aktive Kräfte, Querbrückenstruktur und Querbrückenkinetik.
Projektleiter: Brenner B; Kooperation: Manstein D, Institut für Biophysikalische Chemie, MHH




(II) Nichtmuskuläre Motorproteine, Zellmotilität, Zytoskelett



Charakterisierung prozessiver Myosine mittels TIRF-Mikroskopie und  Laserfalle
Projektverantwortlich: Brenner B. Mitarbeiter: Steffen W, Schweda A, Amrute M, Uta P. Kooperation: Manstein D, Tsiavaliaris G, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'



Arbeitsgruppe Steffen W:
Molekulare Grundlage der Funktionsweise von Myosin 2
Projektleiter: Steffen W; Kooperation: Brenner B, MHH, Manstein D, MHH, Chantler P Royal Veterinary School, London, UK.



Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der optischen Falle.
Projektleiter: Steffen W; Mitarbeiter:  Walter WJ, Lewark S. Kooperationspartner: Koonce M, Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Förderung: DFG



3D Rekonstruktion des Nadelkomplexes von S. flexneri
Projektleiter: Hodgkinson JL, Kooperationen: Blocker AJ, Sir William Dunn School of Pathology, Univ. of Oxford, UK



Arbeitsgruppe Scholz T:
Alternative mechanochemische Reaktionszyklen prozessiver Kinesine
Projektleiter: Scholz T, Mitarbeiter: Hinrichs M, Uta P; Kooperationen: Johnson K, Univ. Texas, Austin, Texas, USA, Manstein D, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH, Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg,; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'



Mechanische Charakterisierung einzelner Myosin- und Kinesinmoleküle mit dem Photonischen Kraftmikroskop
Projektleiter: Scholz T Kooperationen: Hörber H, University of Bristol, UK, Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg.



Klasse 1 Myosine als Regulatoren von Mikrotubulidynamik und Kinesinfunktion
Projektleiter: Scholz T, Mitarbeiter: Uta P; Kooperationen: Rump A, Tsiavaliaris G, Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'




(III) W2-Schwerpunkt "Physiologie" (Kraft T)



Familiäre Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM)



Charakterisierung der funktionellen Auswirkungen von  HCM-assoziierten Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne. Biomechanische Untersuchungen an  Muskelfasern aus  M. soleus-Biopsien von HCM-Patienten.
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Matinmehr F, Piep B, Kirschner S, Seebohm B, Vujevic D. Kooperationen: Navarro-Lopez F, Hospital Clinic, Barcelona, Spanien; AG Öczelik, C, Charité, Berlin; McKenna W, The Heart Hospital, University College London, UK; Förderung: DFG, EU



Funktionelle Auswirkung von HCM-assoziierten Myosinmutationen charakterisiert an einzelnen, permeabilisierten Kardiomyozyten aus explantiertem Myokard transplantierter HCM-Patienten
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Piep B, Beier T, Lingk A. Kooperationen: Navarro-Lopez F, Hospital Clinic, Barcelona, E; Stienen G, Freie Universität Amsterdam, NL; Förderung: Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU



Quantifizierung des Anteils an mutierter kardialer Myosin-Isoform auf mRNA und Protein-Ebene in mykardialem Gewebe und Soleusbiopsien von HCM-Patienten
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Tripathi S, Becker E. Kooperation mit Pich A, Toxikologie, MHH. Förderung: DFG



Die Auswirkungen der HCM-assoziierten W4R Mutation im Muscle Lim Protein (MLP) auf die Funktion von Skelettmuskelfasern untersucht an Muskelfasern aus einem W4R-knock-in Mausmodell.
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: I. Stehle, Geers-Knörr, C, Piep B, Lingk A. Kooperationen: Knöll, R, Herzzentrum, Georg - August Universität Göttingen



Physiololgie/Pathophysiologie des Herzmuskels



Auswirkung der Anreicherung von Phosphat auf Kraftentwicklung und Querbrückenkinetik einzelner, permeabilisierten Kardiomyozyten der Ratte
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Schmell, S, Piep B, Beier T, Lingk A.; Förderung: Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU



Untersuchungen zur Kontraktilität einzelner, intakter Kardiomyozyten aus Primärkultur
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Schmell, S, Piep B, Beier T, Lingk A. Kooperationen: Niederbichler A, Klinik f. Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, MHH; Förderung: Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU




(IV) Bereich 'Vegetative Physiologie'



Mechanismen der metabolischen Anpassung bei der Weiß-Rot-Tranformation des Skelettmuskels. Untersuchungen der Auswirkung von Ca2+-Ionophor bzw. verschiedener Glukosekonzentrationen auf die Aktivität von Energiestoffwechselenzymen sowie die mRNA-Expression und Promoteraktivität ihrer Gene.  
Dr. J. Meißner, Prof. G. Gros.  Förderung DFG GR 489/20.



Intrazelluläre Signalwege der Glucosewirkung bei der Weiß-Rot-Transformation des Skelettmuskels. Dr. N. Hanke, Prof. G. Gros. Förderung DFG Gr 489/20.

CO2-Permeabilität biologischer Membranen: Untersuchungen zu einer neuartigen Messmethode und zu den Mechanismen der Gaspermeation durch Membranproteine, die als Gaskanäle fungieren. Dr. V. Endeward, Dipl.Biol. S. Al-Samir, Prof. G. Gros. Förderung DFG Gr 489/19



Subzelluläre Lokalisation und funktionelle Rolle der membrangebundenen Carboanhydrasen des Skelettmuskels. PD Dr. P. Wetzel, Dipl.Biol. J. Hallerdei, Prof. G. Gros. Förderung DFG





Publikationen



Antognozzi, M., Ulcinas, A., Picco, L., Simpson, S.H., Heard, P.J., Szczelkun, M.D., Brenner, B., Miles, M.J.: A new detection system for extremely small vertically mounted cantilevers. Nanotechnology 2008; 19(384002): 1-10.



Endeward V, Cartron JP, Ripoche P, Gros G. RhAG protein of the Rhesus complex is a CO2 channel in the human red cell membrane. FASEB J. 2008; 22: 64-73



Hanke N, Meissner JD, Scheibe RJ, Endeward V, Gros G, Kubis H-P. Metabolic transformation of rabbit skeletal muscle cells in primary culture in response to low glucose. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 2008. 1783: 813-825



Moll W, Gros G. 2008. Combined glycolytic production of lactate1- and ATP4- derived protons (= dissociated lactic acid) is the only cause of metabolic acidosis of exercise - a note on the OH- absorbing function of lactate1- production. J Appl Physiol. 105, 365



Scheibe RJ, Mundhenk K, Becker T, Hallerdei J, Waheed A, Shah GN, Sly WS, Gros G, Wetzel P. 2008. Carbonic anhydrases IV and IX: their subcellular localization and functional role in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol  294, C402-C412


 

Walter WJ, Zeilinger C, Bintig W, Kolb HA, Ngezahayo A.: Phosphorylation in the C-terminus of the rat connexin46 (rCx46) and regulation of the conducting activity of the formed connexons. J Bioenerg Biomembr. 40: 397-405 (2008)




Abstracts



2008 wurden 13 Abstracts publiziert

Promotionen



Radocaj A (Dr.rer.nat.): Structural states associated with the power stroke of myosin heads in muscle: a 2D-X-ray diffraction study



Dunda S (Dr. med.): Familiäre Hypertrophe Kardiomyopathie. Funktionelle Auswirkungen von Punktmutationen in der schweren Kette des Myosins auf die Kalzium-Empfindlichkeit von Einzelfasern des humanen Musculus soleus.




Weitere Tätigkeiten in der Forschung



Brenner B: Gutachter für DFG, Medical Research Council UK, diverse Zeitschriften.



Kraft T: Gutachterin für DFG und diverse Zeitschriften.



Steffen W: Gutachter für diverse Zeitschriften.



Gros G: Mitglied des Vorstands der Dt. Physiologischen Gesellschaft, bis März 2008 Präsident der Dt. Physiologischen Gesellschaft. Bis Oktober 2008 Programmverantwortlicher des Masterprogramms Biomedizin der MHH. Referent für diverse Forschungsförderungsorganisationen und Zeitschriften.



Meißner J: Referent für diverse Zeitschriften