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Forschungsbericht 2003

 

 

Chemisch-biologische Wechselwirkungen zwischen Bestandteilen von Kunststoff-modifizierten Füllungsmaterialien und menschlichen primären Zellen der Mundhöhle

Leyhausen G, Engelmann J, Volk J, Geurtsen W.

Förderung: DFG LE 851/2-2

 

Aus früheren Studien war bekannt, dass auf Kunststoffen basierende Füllungsmaterialien weder nach ihrer Verarbeitung noch nach Aushärtung als inert anzusehen sind. So war und ist das primäre Ziel unseres Forschungsvorhabens, den Einfluss von Kunststoff-modifizierten Füllungsmaterialien und deren Bestandteilen (z.B. TEGDMA) auf spezifische Zellfunktionen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass TEGDMA, welches aus vielen zahnärztlichen Kunststoffen in beträchtlichen Mengen abgegeben wird, Veränderungen im Stoffwechsel der Zielzellen auslösen kann. Dabei untersuchten wir den Einfluss von toxischen und subtoxischen Konzentrationen von TEGDMA und anderen Monomeren auf Apoptose und Glutathion, welches eine zentrale Rolle beim Schutz von Zellen gegen Fremdstoffe (Xenobiotika) und gegen oxidative Schäden einnimmt. Der  signifikante Konzentrationsabfall dieses Metaboliten durch Methacrylat-haltige Monomere legte es nahe, die Zellen ebenfalls auf die Bildung sogenannter reaktiver Sauerstoff-Spezies (ROS) zu untersuchen. Auch hier konnte ein deutlicher Effekt durch Bestandteile von Kunststoff-Füllungsmaterialien nachgewiesen werden.

Die gewonnenen Daten geben wichtige Hinweise zur Wirkung subtoxischer Konzentrationen von heraus lösbaren Inhaltsstoffen zahnärztlicher Materialien im Hinblick auf lokale und vor allem auch systemische Wirkungen. Weitere Untersuchungen zur Klärung der sehr unterschiedlich wirkenden und metabolisierten Kunststoffbestandteile sind geplant (Fortsetzungsantrags bei der DFG).

 

Durchgeführte Untersuchungen während des Förderzeitraums:

Zellulärer Glutathionstoffwechsel; Fragestellung: Haben Kompositbestandteile Einfluss auf den für Redoxprozesse wichtigen Metaboliten Glutathion?

Aufgrund ihrer Reaktivität sind Methacrylate in der Lage, mit wichtigen zellulären Nukleophilen (z.B. freie Sulfhydrylgruppen in Enzymen, reduziertes Glutathion, Amino- und Amidfunktionen) zu reagieren. Hierbei spielt vor allem das ubiquitär in Eukaryonten vorkommende Tripeptid Glutathion eine besondere Rolle, da es als reduzierendes Agens und Antioxidans an einer Vielzahl wichtiger metabolischer Prozesse beteiligt ist. So ist es auch maßgeblich an der Detoxifizierung von Xenobiotika beteiligt, zu denen auch Monomere gehören. In den im MHH-Bericht 2000 dargestellten Ergebnissen aus den NMR-Studien zeigte sich, dass die intrazelluläre Glutathion-Konzentration bereits durch subtoxische Konzentrationen an TEGDMA deutlich, zum Teil unter die Nachweisgrenze der NMR-Spektroskopie, abgesenkt wird. Damit wird ein wesentlicher Schutzmechanismus der Zellen gestört und sie werden empfindlicher gegen toxische Effekte anderer Verbindungen. Deshalb wurde ein empfindliches Testsystem in Mikrotiterplatten zur Bestimmung des zellulären Glutathiongehaltes entwickelt und etabliert, um den Einfluss von Monomeren (TEGDMA) auf die intrazelluläre Glutathionkonzentration von humanen Gingivafibroblasten (HGF) zu untersuchen. Bei dem Assay handelt es sich um eine fluoreszenzspektroskopische Methode zur Detektion von Glutathion durch Monobromobiman, kombiniert mit einer ebenfalls auf Fluoreszenz beruhenden Bestimmung der Zellzahl und Vitalität der Zellen mit Propidiumiodid. Die beobachtete zeit- und dosisabhängige Erniedrigung des Glutathionspiegels lässt vermuten, dass dieser Effekt zum zytotoxischen Potential von TEGDMA beiträgt.

Diese Daten veranlassten uns weitere Methacrylatgruppen-tragende (Ko)Monomere zu untersuchen und mit denen von TEGDMA zu vergleichen. Es zeigte sich, dass die Kompositbestandteile Bis-GMA, UDMA und HEMA ebenfalls den intrazellulären Glutathiongehalt erniedrigten (Abbildung 1). Der deutlich schwächere Effekt von HEMA mit einer Methacrylgruppe im Vergleich zu den beiden Dimethacrylaten, lässt auf eine Rolle der Anzahl dieser Gruppe im Molekül bei der Wirkung auf den Glutathiongehalt schließen.

 

Als nächstes wurden zeit- und dosis-abhängige Untersuchungen mit Bis-GMA durchgeführt. Hier zeigte sich, wie für TEGDMA, dass ab einer Grenzkonzentration (TEGDMA: 2,5-5 / Bis-GMA: 0.075 - 0.1 mM) keine Erholung des Glutathiongehaltes zu beobachten war, ebenfalls verbunden mit einer Abnahme der Zellvitalität.

Erste Untersuchungen mit Komposit-Eluaten haben gezeigt, dass die aus den kommerziellen Kunststofffüllungen eluierten Substanzen die intrazelluläre Glutathionkonzentration von humanen Pulpafibroblasten nachhaltig beeinflussen können. Da Eluate „natürliche“ Mischungen von Monomeren, Photoinitiatoren, Akzeleratoren usw. sind, ist es von besonderem Interesse mögliche interaktive Effekte dieser Stoffe auf den Glutathionspiegel der Zelle mit Hilfe von definiert hergestellten Mischungen zu untersuchen.

 

Etablierung einer Meßmethode zur Bestimmung reaktiver oxigener Spezies (ROS). Fragestellung: Führt die Erniedrigung des Glutathionspiegels durch Kompositbestandteile möglicherweise zu einer erhöhten Bildung von ROS?

In weiteren Versuchen wurde der Einfluss von TEGDMA, dem Photoinitiator Campherchinon (CQ) und Wasserstoffperoxid (H2O2) auf die spontane intrazelluläre Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in humanen Pulpafibroblasten (HPF) untersucht. Dazu wurde ein Test mit dem Farbstoff Dichlorfluorescin-diacetat (DCFH-DA) in Mikrotiterplatten für diese Zellen etabliert. Die durch die Bildung der ROS entstehende Fluoreszenz wurde über 90 Minuten im Fluoreszenzspektrometer gemessen. Die kinetischen Auswertungen wurden in Relation zu den unbehandelten Kontrollen gesetzt und Zellzahl-korreliert (Propidiumiodid-Assay) ausgewertet. TEGDMA induziert nur bei Konzentrationen oberhalb von 2.5 mM eine leicht verstärkte Bildung von ROS. Dies ist wohl auf die schnelle Abnahme des Antioxidans Glutathion zurückzuführen, die bei der Behandlung mit TEGDMA zu beobachten ist.

Dagegen führt die Behandlung mit dem Photoinitiator CQ bereits bei 1 mM zu einem sehr schnellen Ansteigen der ROS, auch ohne Bestrahlung (Abbildung 2). Dies kann nur durch die intrazelluläre Bildung von ROS durch Reaktion der chinoiden Struktur des Photoinitiators erklärt werden. Die extrazelluläre Gabe von Wasserstoffperoxid, das selber zu den ROS zählt, führt ebenfalls zu einer beschleunigten Reaktion mit dem Farbstoff durch die Diffusion des Peroxids durch die Zellmembran.

 

Untersuchungen zur Apoptose. Fragestellung: Beeinflussen Kompositbestandteile die Apoptoserate?

ROS können eine wichtige Rolle als Regulatoren der Apoptose spielen, da u.a. Oxidantien Apoptose induzieren, während Antioxidanzien wie GSH Apoptose verzögern oder verhindern können. In ersten Versuchen wurden die Effekte von TEGDMA und BisGMA, die beide den GSH-Gehalt in Zellen reduzieren, auf die Proliferation und die Apoptose von humanen Gingivafibroblasten (HGF) untersucht. TEGDMA (5 mM und 7,5 mM, 24h) und BisGMA (0,1 mM) induzierten eine Reduktion des Volumens, eine Chromatinkondensation und eine Apoptose-typische DNA-Fragmentierung. Die Apoptoserate wurde mittels Annexin/PI-Färbung mit der Durchflusszytometrie (FACS) quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass beide Dimethacrylate den Zelltod fast ausschließlich durch Apoptose in Abhängigkeit von der Konzentration und der Inkubationszeit induzierten. Die Konzentrationen, bei denen diese Effekte zu beobachten sind, waren sowohl für TEGDMA als auch für Bis-GMA dieselben, die zu einer andauernden Erniedrigung des intrazellulären Glutathionsgehaltes führten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch beide Dimethacrylate induzierte Apoptose zumindest teilweise über eine Modulation des zellulären Glutathion Redoxsystems ausgelöst wird. Mit diesen Untersuchungen konnten wir zeigen auf welchen Stoffwechselebenen die in früheren Studien dokumentierte Zytotoxizität vieler Komposit-Bestandteile Einfluss auf die Zellen hat.