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Forschungsbericht 2005

 

Chemisch-biologische Wechselwirkungen von Kombinationen von Peroxiden und metallischen bzw. organischen Inhaltsstoffen zahnärztlicher Materialien auf das antioxidative System menschlicher oraler Zellen

 

Volk J, Leyhausen G, Dogan S, Geurtsen W.

Förderung: DGZMK

 

Zum Bleichen von Zähnen wird als aktive Komponente in erster Linie Wasserstoffperoxid (H2O2) eingesetzt, dass in relativ hohen Konzentrationen in Kontakt mit oralen Zellen tritt, leicht Zellmembranen durchdringt und zu einer oxidativen Belastung der Zellen führen kann. Die Förderung von oxidativem Stress scheint eine wichtige Rolle im Mechanismus der akuten Toxizität und Mutagenität von Methacrylaten wie Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA) zu spielen. Das Ziel unserer Untersuchungen ist, Ursachen und Auswirkungen der schädigenden Wirkung von oxidativem Stress erzeugt durch H2O2 allein und in Kombination mit Bestandteilen von zahnärztlichen Kunststoffen (TEGDMA) in subtoxischen Konzentrationen zu untersuchen. Zur Erfassung der Ursachen werden die intrazellulären Glutathiongehalte und Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff-Spezies („reactive oxygen species“, ROS) gemessen. Die gesetzten Schäden werden anhand der Änderungen der Apoptoseinduktion (mitochondriales Membranpotential, DNA-Fragmentierung, Nachweis der Phosphatidylserinumlagerung in den Zellmembranen) und der Zytotoxizität (PI-Assay, LDH-Assay) erfasst. Alle Untersuchungen werden mit menschlichen Fibroblasten der Mundhöhle durchgeführt (humane Gingivafibroblasten (HGF), humane Pulpafibroblasten (HPF), humane Parodontalligamentfibroblasten (HPDLF)). Die ermittelten Daten geben wichtige Hinweise zur Wirkung subtoxischer Konzentrationen von eluierbaren Inhaltsstoffen zahnärztlicher Materialien als Einzelkomponenten und in Kombination mit Wasserstoffperoxid aus Bleichmitteln.

 

Das Forschungsprojekt bearbeitet folgende Fragestellungen:
(1) Welchen Einfluss hat TEGDMA allein und in Kombination mit Wasserstoffperoxid auf den Glutathionsstoffwechsel von humanen oralen Zellen?

Über die zytotoxischen Effekte (Auswirkungen auf den Zellmetabolismus) von löslichen Bestandteilen zahnärztlicher Kunststoffe in Kombination mit Wasserstoffperoxid ist wenig bekannt. Wir untersuchten den Einfluss von toxischen und subtoxischen Konzentrationen des häufig vorkommenden Komonomers TEGDMA allein und in Kombination mit Wasserstoffperoxid (H2O2) auf den intrazelluären Glutathiongehalt (GSH) von oralen Fibroblasten. GSH spielt in der Zelle eine zentrale Rolle beim Schutz vor oxidativen Schäden, eine irreversible Beeinträchtigung des GSH-Gleichgewichts kann zu einer letalen Schädigung der Zelle führen.

Unsere bisherigen Untersuchungen zeigten, dass TEGDMA konzentrationsabhängig zu einer Erniedrigung des GSH-Gehalts der Fibroblasten führte, die mit einer Abnahme der Vitalität korrelierte. Durch eine aufeinanderfolgende Exposition der Zellen mit TEGDMA und 0,2 mM H2O2 wurden diese Effekte additiv verstärkt.

Diese Ergebnisse führten zu der Fragestellung (2) des Projekts: Induziert TEGDMA allein und in Kombination mit Wasserstoffperoxid eine erhöhte Bildung von intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)?

In früheren Untersuchungen konnten wir bereits nachweisen, dass nicht nur TEGDMA sondern auch weitere Methacrylate aus zahnärztlichen Kunststoffen eine Erniedrigung des intrazellulären GSH induzieren können. Aufgrund dessen wurde von uns untersucht, ob es in den behandelten Zellen zu einer erhöhten Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies („reactive oxygen species“, ROS) kommt, die durch H2O2 noch verstärkt wird.

In Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass DMSO als Lösungsmittel für TEGDMA in der eingesetzten Konzentration von 0,5% als Radikalfänger fungiert. Daher wurde anschließend Ethanol, das diesen Effekt nicht aufweist, als Lösungsmittel für die weiteren Experimente verwendet. Die Abbildung 1 zeigt die durch TEGDMA induzierte konzentrationsabhängig erhöhte ROS-Bildung in HGF unter Verwendung von EtOH als Lösungsmittel für TEGDMA, während der Effekt von DMSO als Radikalfänger deutlich wird.

 

Erste Ergebnisse zur Kombinationsbehandlung mit H2O2 deuten auf einen synergistischen Effekt bei der ROS-Entwicklung in den untersuchten Zellen hin. Die Abbildung 2 zeigt eine Zusammenfassung der Messwerte zur Kombinationsbehandlung im Vergleich zu Einzelbehandlungen mit TEGDMA als auch mit 0,2 mM H2O2. Die Zunahme der ROS-Entwicklung (2a) korrelierte mit der Abnahme an intrazellulärem GSH und der Abnahme der Zellvitalität (2b).

 

Unsere Ergebnisse zeigen, dass TEGDMA allein und besonders in Kombination mit H2O2 den Metabolismus und die Vitalität oraler Zellen bereits in sehr geringen Konzentrationen, wie sie in der Mundhöhle auftreten können, beeinträchtigt.

Da Zellfunktionen wie der Glutathionspiegel und die ROS-Bildung eine Rolle im Zusammenhang mit dem Mechanismus des Zelltods spielen ergab sich die folgende  Fragestellung (3): Führt die erhöhte ROS-Bildung zur Induktion von Apoptose (programmierter Zelltod)?

 

Das mitochondriale Membranpotential (MMP) über die innere mitochondriale Membran stellt die wichtigste Energiequelle tierischer Zellen dar. Das Absinken dieses Membrangradienten ist ein charakteristisches Merkmal während der Apoptose. Wir etablieren in unserem Labor folgende Methode um Änderungen des MMP in Mikrotiterplatten zu bestimmen. Die Messung des MMP erfolgt mit einem Fluoreszenzfarbstoff (JC-1). JC-1 wird von Mitochondrien aufgenommen und ändert dabei seine Fluoreszenzeigenschaften, da es in der mitochondrialen Matrix aggregiert. Liegt das MMP bei –170 mV bis –220 mV, so bilden sich JC-1-Aggregate mit Rotfluoreszenz, verringert sich der Betrag des Membranpotentials, so bilden sich JC-1-Monomere mit Grünfluoreszenz. Dieses System bietet die Möglichkeit, eine Vielzahl verschiedener Wachstums- und Behandlungsbedingungen in relativ kurzer Zeit mit dem in unserem Labor zur Verfügung stehenden Fluoreszenzreader zu untersuchen. Die Versuche führten zur Optimierung der Konzentration von JC-1 zur Beladung der Zellen. Die Abbildung 3 zeigt den akuten Effekt von FCCP (Carbonyl Cyanid p-Trifluoromethoxyphenylhydrazon), einem Entkoppler der mitochondrialen Atmungskette, auf das MMP. In humanen Gingivafibroblasten induzierten 0,25 µM FCCP einen plötzlichen und 0,05 µM FCCP einen allmählichen Anstieg der JC-1-Fluoreszenzrate, und damit ein Absinken des Membrangradienten. Die in den Kontrollmedien (0,25 mM DMSO bzw. PBS) inkubierten Zellen zeigten über 40 min keine Änderungen des MMP. Dieser Assay soll in folgenden Experimenten Aufschlüsse über die Auswirkungen von Methacrylaten aus zahnärztlichen Kunststoffen auf das MMP oraler Zellen geben.

 

 

Die Inhaltsstoffe zahnärztlicher Materialien werden zwar zunächst in der Mundhöhle freigesetzt und wirken lokal auf die dort vorhandenen Zellen ein, sie gelangen aber auch durch Verschlucken in den gastrointestinalen Trakt. Während der Darmpassage erfolgt ein Kontakt mit der Darmmukosa und es kann zur Resorption und Verteilung im gesamten Organismus kommen, wie es in Tierversuchen z. B. für Methacrylate schon gezeigt wurde. Es liegen jedoch nur wenige  Informationen darüber vor, ob Bestandteile zahnärztlicher Werkstoffe auch systemische Langzeiteffekte bewirken können, wie eine Schädigung der DNA und Mutationen. Diese Thematik ist Grundlage eines neuen DFG-Antrags. Dafür sind bereits einige Vorarbeiten zur oxidativen Schädigung der DNA durchgeführt worden mit der Fragestellung (4) unseres Forschungsprojekts: Haben antioxidative Agentien einen Einfluss auf die durch Monomere und Initiatoren verursachten Schäden an der DNA?

Frühere Untersuchungen hatten in vitro bereits gezeigt, dass der Initiator Campherchinon mit Licht (visible light; VL) aktiviert und in Anwesenheit eines tertiären Amins (z.B. DMT; N,N-dimethyl–p-toluidin) ROS generiert und die DNA von Zellen oxidativ schädigt. Dabei wurden abasische Stellen und Doppelstrangbrüche festgestellt. Der Einfluss der Antioxidantien N-Acetyl-L-cystein (NAC), Mannitol, der Vitamine C und E und auch von Glutathion auf die Induktion von Doppelstrangbrüchen wurde mit Hilfe der Bestimmung der Konversionsrate von doppelsträngiger supercoiled Plasmid-DNA (ФX-174 RF I ) in die offene, lineare Form untersucht.

Dabei zeigte sich, dass die Vitamine und Mannitol das Ausmaß oxidativer Schäden weniger effektiv reduzierten, während NAC und Glutathion sich als deutlich wirksame Antioxidantien herausstellten. Darüber hinaus erhöhte die Zugabe der Vitamine E und C sogar signifikant die durch VL allein verursachten DNA-Schäden ebenso wie die durch CQ/DMT und VL-Bestrahlung induzierten Schäden. Das Ziel unserer weiteren Untersuchungen wird u.a. sein, die durch geringe Konzentrationen an CQ + DMT und auch TEGDMA verursachte Formation von abasischen Stellen in der DNA zu analysieren.

 

Geurtsen W, Leyhausen G, Volk J, Pagoria D, Winter K, Dogan S.

Förderung durch DGZMK, Dean und Margaret Spencer Fund, RRF-UW; DFG-Antrag eingereicht; NIH- Antrag in Vorbereitung