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Forschungsbericht 2006

Oxidative Schäden durch zahnärztliche Kunststoffbestandteile an oralen Zellen

Volk J, Leyhausen G, Geurtsen W.

Alle zahnärztlichen Kunststoffe geben auch nach der Polymerisierung organische Inhaltsstoffe ab, welche zunächst in der Mundhöhle freigesetzt werden. Sie wirken lokal auf die dort vorhandenen Zellen ein, gelangen aber auch durch Verschlucken in den gastrointestinalen Trakt. Während der Darmpassage erfolgt ein Kontakt mit der Darmmukosa und es kann zur Resorption und Verteilung im gesamten Organismus kommen. Somit ist deren Auswirkung nicht nur auf den oralen Bereich beschränkt. Jedoch liegen bisher nur wenige Informationen darüber vor, ob Bestandteile zahnärztlicher Werkstoffe auch systemische Langzeiteffekte bewirken können, z.B. über die Beeinflussung von zentralen intrazellulären Stoffwechselwegen. Die Fragestellung unseres ersten Teils des Forschungsprojekts ist (1): Welchen Einfluß hat die durch den Photoinitiator Campherchinon (CQ) induzierte intrazelluläre Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies („reactive oxygen species“, ROS) auf zentrale Stoffwechselwege von oralen primären humanen Fibroblasten? CQ ist einer der am meisten verwendeten Photoinitiatoren in zahnärztlichen Adhäsiven und Kompositen, der auch nach der Polymerisation in Eluaten dieser Materialien nachgewiesen wird. Zunächst wurde die Wirkung von CQ (0,05 mM bis 2,5 mM) auf den intrazellulären Glutathiongehalt und auf die Bildung von ROS in humanen Gingivafibroblasten (HGF) mit fluoreszenzspektroskopischen Methoden bestimmt.

Die Ergebnisse  zeigen, dass niedrige Konzentrationen von CQ in humanen Gingivafibroblasten zu einer erhöhten Bildung von ROS beitragen, in der Folge einen massiven Konzentrationsabfall an Glutathion (GSH) bewirken und damit den Oxidationsschutz der Zelle erniedrigen (Abbildung 1 A und B).

 

Triethyldimethacrylat (TEGDMA), ein weiterer häufig verwendeter Inhaltsstoff von Kompositen und andere Methacrylate wurden in früheren Untersuchungen ebenfalls auf ihre Beeinflussung des Oxidationsstatus der Zelle untersucht. Die Behandlung  von primären Fibroblasten mit diesen Stoffen führte konzentrationsabhängig zu einer Erniedrigung des GSH-Gehalts. In der Folge konnten wir gleichermaßen eine erhöhte Bildung von ROS nachweisen, die mit einer Abnahme der Vitalität korrelierte.

Für eine Reihe von verschiedenen Zelltypen wurde bereits nachgewiesen, dass die Erhöhung von ROS zum programmierten Zelltod (Apoptose) führen kann. Daher ergab sich die  Fragestellung (2) unseres Projektes: Induzieren CQ und TEGDMA über eine Erhöhung der intrazellulären ROS-Bildung Apoptose in primären  Gingivafibroblasten?

Die Apoptose, ein für die Entwicklung und Aufrechterhaltung eines vielzelligen Organismus lebenswichtiger Mechanismus, ist ein streng regulierter zellulärer Prozeß, dessen Beeinflussung zu massiven Funktionsstörungen innerhalb der betroffenen Zellen und demzufolge im Gewebe führen kann.

In ersten Messungen zur Induktion der Apoptose konnte mit einem Chemiluminszenzassay bereits nach 5 Stunden eine Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7 durch CQ nachgewiesen werden. Diese Caspasen nehmen  innerhalb der Apoptose eine zentrale Rolle ein. In weiteren Untersuchungen wurde nach Inkubation der Zellen mit CQ eine gelelektrophoretische Auftrennung der isolierten DNA durchgeführt. Mit dieser Methode konnte nach 16–stündiger Behandlung eine Apoptose-typische DNA-Fragmentierung (DNA laddering) nachgewiesen werden (Abbildung 2).

 

Parallel durchgeführte fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen mit den Fluorochromen Akridinorange und Ethidiumbromid belegen dieses Ergebnis (Abbildung 3). Akridinorange (AO) ist Zellmembran durchlässig und färbt DNA grün, während Ethidiumbromid (EB) bei Verlust der Membranintegrität in Zellen eindringt und die DNA rot färbt (DNA erscheint hier gelb-orange bei gleichzeitiger AO Fluoreszenz).

Nach Behandlung mit CQ zeigten die Fibroblasten ein typisches membrane blebbing (3a). Die Fluoreszenzaufnahme (3b) zeigt, dass sich innerhalb der Vesikel mit intakter Membran fragmentierte DNA befindet. Spät-apoptotische Zellen oder solche, die direkt Nekrose erleiden, erscheinen gelb-orange. Die unbehandelten Kontrollzellen zeigten dagegen keine veränderte Morphologie (3c, d).

Ein weiteres charakteristisches Merkmal der Apoptose ist das Absinken des mitochondrialen Membranpotentials (MMP) über die innere mitochondriale Membran. Die Messung des MMP erfolgte mit einem Fluoreszenzfarbstoff (JC-1). Dieser Farbstoff  wird von den Mitochondrien aufgenommen und ändert dabei seine Fluoreszenzeigenschaften, da es in der mitochondrialen Matrix aggregiert. Liegt das MMP bei –170 mV bis –220 mV (unbehandelte Kontrollzellen), so bilden sich JC-1-Aggregate mit Rotfluoreszenz. In apoptotischen Zellen kollabiert das MMP und es bilden sich JC-1-Monomere mit Grünfluoreszenz.

Unsere Untersuchungen zeigten, dass kurze Inkubationen (90 Minuten, 6 Stunden) von HGF mit TEGDMA (0.5 mM bis 5 mM) eine frühe und schnelle Abnahme des intrazellulären GSH-Gehalts induzierten und bereits nach 90 Minuten eine deutlich erhöhte Bildung von intrazellulären ROS zur Folge hatten. Nach 6 Stunden konnten wir gleichzeitig eine deutliche Abnahme der JC-1-Fluoreszenzrate und damit eine für Apoptose typische Depolarisierung des MMP nachweisen (Abbildung 4).

Zusammengefasst zeigen unsere bisherigen Ergebnisse, dass Substanzen aus zahnärztlichen Kunststoffen den Metabolismus (Glutathionhaushalt, reaktive Sauerstoffspezies) und die Vitalität oraler Zellen bereits in sehr geringen Konzentrationen, wie sie in der Mundhöhle auftreten können, beeinträchtigen und in vitro Apoptose induzieren. Die Auswirkungen auf systemische (intestinale) Zellen sind bisher noch wenig untersucht und werden zentraler Bestandteil unserer zukünftigen Forschungsprojekte sein. Einen weiteren Schwerpunkt unserer Untersuchungen bilden die Ursachen, die zur Auslösung von Apoptose führen, und der Einfluß von CQ und Methacrylaten auf die DNA von Zellen in Hinblick auf  deren  potentielle Gentoxizität. Die Identifizierung und Aufklärung potentiell pro-apoptotischer und mutagener Wirkmechanismen dieser Materialien liefern wichtige Daten für die Entwicklung biokompatibler Alternativen zu existierenden Materialien.