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Forschungsbericht 2016

Forschungsberichte 2008 , 2009 , 2010 , 2011 , 2012 , 2013 , 2014 , 2015 , 2016

 

Forschungsprofil

Das Institut für Molekular- und Zellphysiologie beschäftigt sich mit den molekularen Funktionsprinzipien sog. Motorproteine.

 

Diese treiben einen Großteil der bekannten Bewegungs- und Transportprozesse an. Dazu gehören intrazelluläre Transportprozesse, Formänderungen von Zellen sowie verschiedensten Arten der Fortbewegung von Zellen oder ganzer Organismen. Für die Vielfalt der Transport- und Bewegungsphänomene sind Motorproteine aus drei Familien verantwortlich. Die Myosine, die mit Aktinfilamenten interagieren, sowie die Dyneine und Kinesine, die Kräfte und Bewegungen im Zusammenspiel mit Mikrotubuli erzeugen. In den vergangenen Jahren ist die Bedeutung solcher Motorproteine für verschiedenste Erkrankungen in das Zentrum des Interesses des Instituts gerückt. Zu Erkrankungen, die auf Veränderungen in den Motorproteinen selbst oder in assoziierten Proteinen beruhen, gehören z.B. die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM), degenerative Erkrankungen der Motoneurone, die Alzheimer-Demenz oder die Metastasierung von Tumoren.

 

 

Unser Ziel ist aufzuklären, wie Mutationen in Motorproteinen oder in assoziierten Proteinen die molekularen Funktionsprinzipien der Motorproteine verändern und zu entsprechenden Krankheitsbildern führen. Ein Fokus ist die Aufklärung direkter funktioneller Auswirkungen von Punktmutationen in der β-kardialen schweren Kette von Myosin 2, die zum Bild der hypertrophen Kardiomyopathie (HCM) führen. Die Aufklärung direkter funktioneller Auswirkungen HCM-assoziierter Mutationen kann einerseits Ansatzpunkte für korrigierende Beeinflussung der primären Funktionsstörungen und des resultierenden Krankheitsbildes eröffnen, andererseits erlauben sie Einblick in die molekularen Funktionsprinzipien der Motorproteine.

 

 

Der derzeitige Hauptfokus ist die Frage, wie verschiedene Punktmutationen, auch in anderen sarkomerischen und nicht-sarkomerischen Proteinen, zum Phänotyp der familiären hypertrophen Kardiomyopathie führen können. Richtungsweisend war eine von uns gemachte Beobachtung, dass durch HCM-assoziierte Punktmutationen verursachte funktionelle Veränderungen im Myokard betroffener Patienten von Zelle zu Zelle sehr unterschiedlich ausgeprägt sind. Manche Zellen zeigen sogar völlig der Norm entsprechendes Verhalten als ob in diesen Zellen kein mutiertes Protein exprimiert wurde. Inzwischen konnten wir zeigen, dass entsprechend dieser funktionellen Varianz ein von Zelle zu Zelle unterschiedlicher Anteil mutierter mRNA exprimiert wird. Manche Zellen exprimieren praktisch ausschließlich wildtyp mRNA während andere Zellen fast ausschließlich mutierte mRNA exprimieren. Die resultierende funktionelle Variabilität zwischen benachbarten Kardiomyozyten verursacht im zellulären Netzwerk des Myokards Distorsionen im Gewebeverband, die zum FHC-typischen zellulären und myofibrillären Disarray mit Fibrose und Hypertrophie führen.

 

 

Inzwischen konnten wir zeigen, dass die Ursache der Zell zu Zell Variabilität des Anteils an mutiertem Protein vermutlich darauf beruht, dass mutiertes und wildtyp-Allel unabhängig voneinander in zufälligen bursts transkribiert werden. Erste Tests bestätigen diese Hypothese, mit der wir das gesamte Spektrum unserer bisher erhobenen Daten quantitativ (per Modellrechnung) erklären können. Dieses Konzept lässt erwarten, dass jede Mutation in einem sarkomerischen oder auch nicht-sarkomerischen Protein (z.B. Kinasen), die zu einer funktionellen Änderung im Sarkomer führt über eine solche zufällige, burst-like Transkription zu funktionellem Ungleichgewicht zwischen einzelnen Kardiomyozyten führt und somit den Phänotyp einer hypertrophen Kardiomyopathie auslösen kann.

 

 

In unseren bisherigen Untersuchungen waren wir auf Myokardproben aus Myektomien oder Explantaten betroffener FHC-Patienten beschränkt. Um auch longitudinale Studien zur Pathogenese der FHC angehen und auch Mutationen  untersuchen zu können, für die wir keinen Zugang zu Patientenproben haben, etablieren wir derzeit drei Ansätze;  die Differenzierung von Kardiomyozyten über induzierte pluripotente Stammzellen aus Hautfibroblasten betroffener  Patienten, die Expression von Kopfdomänen des kardialen Myosins in einer humanen, ventrikulären Zelllinie, und die  Entwicklung eines Tiermodells (Schwein), das erlaubt, die Entwicklung des FHC-Phänotyps im Detail zu verfolgen.

 

 

Zur  funktionellen Charakterisierung der Proben haben wir ein breites Methodenspektrum etabliert, um auch an kleinsten  Proben, z.B. Myofibrillen oder direkt am Einzelmolekül mittels Laserfalle und TIRF-Mikroskopie funktionelle Auswirkungen von HCM-Mutationen charakterisieren zu können.

 

Ausgewähltes Forschungsprojekt

 

  • Transmission Electron Microscopy -> Single particle image analysis ->3D Reconstruction: Skeletal  muscle myosin-2 sub-fragment-1   

We are investigating the structure of isolated myosin sub-fragment-1 (S1) domains in different states of the cross-bridge  cycle of muscle contraction using low dose transmission electron microscopy (TEM), single particle image analysis and  3D reconstruction. Due to the difficulty in crystallising them there is a dearth of crystal structures of full length isolated  S1 with only one structure for a vertebrate myosin-2 and none for a mammalian myosin-2. Subfragment-1 is a 110 kDa,  functional, molecular fragment of the myosin molecular motor, with an approximate length of 16.5 nm, width of 6.5  nm and depth of 4 nm. Sequence and solution studies and the few crystal structures of full length S1 suggest there  are substantial differences in structure and function for different myosins and isoforms, making structural comparison  important. Single particle analysis and 3D reconstruction of such a small molecule in isolation are challenging and we  chose to develop a method using the relatively stable rigor state. .......

 

 

 

Created with GIMP
Created with GIMP

The length and appearance of the majority of classes suggested a majority of side views around the long axis and allowed us to produce a 3D reconstruction and model of the isolated molecule (manuscript submitted). Studying S1 in three dimensions is an important criteria in fully understanding the structure of the motor, which is highly dynamic in it’s function. This is the first full length structure of a mammalian myosin-2 sub-fragment. The method offers potential for comparing the structure of the S1 between species at a time when it is becoming increasingly clear that there are significant differences in structure which presumably help tailor function in different myosins and isoforms.

    Projektleitung: Hodgkinson, Julie Lynne (Dr.); Kooperationspartner: Morris, Edward (Dr.), The Institute of Cancer Research, London, UK; Steffen, Walter (PD Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH

     

     

    Weitere Forschungsprojekte (mit Stichtag 01.12.2016)

    • Quantifizierung der Transkription der β-kardialen schweren Myosinkette (Wildtyp-Allel, mutiertes Allel) mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (smFISH)

    Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.), Kowalski, Kathrin; Kooperationspartner: Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin; Förderung: DFG

    • Quantitatives Modellieren einer burst-like Transkription von wildtyp und mutiertem MYH7 Allel (β-kardiale schwere Myosinkette) als Grundlage der beobachteten Zell zu Zell Variabilität der mutierten mRNA, des mutierten Proteins und der resultierenden funktionellen Variabilität

    Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Radocaj, Ante (Dr.); Förderung: DFG

    • Hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie: Genotypisierung und Charakterisierung des molekularen Phänotyps durch Untersuchungen an isolierten Kardiomyozyten aus Myektomiegewebe

    Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Perrot, Andreas, Charité, Berlin; Thum, Thomas (Prof. Dr.), IFB-Molekulare und Translationale Therapiestrategien, MHH; Mühlfeld, Christian (Prof. Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Pabst, Brigitte (Dr.), Institut f. Humangenetik, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Dos Remedios, Cris (Prof. Dr.), University of Sydney, Sydney, AUS; van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.), Vrije Universiteit Amsterdam, NL; Förderung: DFG; StrucMed, MHH

    • Kardiomyozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Punktmutationen im β-kardialen Myosin als in vitro Modell der Familiären Hypertrophen Kardiomyopathie

    Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Zweigerdt, Robert (Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Schwanke, Kristin (Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Martin, Ulrich (Prof. Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Fischer, Martin (Dr.), Neurophysiologie, MHH; Wrede, Christoph (Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Hegermann, Jan (Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Förderung: DFG; StrucMed, MHH 

     

    • Einfluss der Kultivierungsbedingungen auf Funktion und Proteinexpression von Kardiomyozyten aus humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

    Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Zweigerdt, Robert (Dr.) HTTG Chirurgie, MHH; Schwanke, Kristin (Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Martin, Ulrich (Prof. Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Fischer, Martin (Dr.), Neurophysiologie, MHH; Förderung: DFG

      

    • Generierung eines Schweinemodells der Hypertrophen Kardiomyopathie mit Punktmutation im β-kardialen Myosin zur Charakterisierung der Pathogenese der FHC

    Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Montag, Judith (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Niemann, Heiner (Prof. Dr.), FLI Mariensee; Petersen, Björn (Dr.), FLI Mariensee; Förderung: DFG, Exzellenzcluster DFG, Exzellenzcluster REBIRTH (DFG)

      

    • Expressionsanalyse mutierter β-Myosin-mRNA in einzelnen, laser-mikrodissektierten Kardiomyozyten aus Gewebe von Patienten mit Familiärer Hypertropher Kardiomyopathie (single-cell-level allelic imbalance)

    Projektleitung: Montag, Judith (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.);
    Kooperationspartner: Wissel, Kirsten (Dr.) HNOKlinik,  MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin; Dos Remedios, Cris (Prof. Dr.), University of Sydney, Sydney, AUS; van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.), Vrije Universiteit Amsterdam, NL; Ho, Carolyn, Harvard Medical School, Brigham and Women's Hospital, Boston, USA; Förderung: DFG

      

    • Relative Quantifizierung des Anteils an wildtyp - und mutiertem β-kardialem Myosin in Myokardgewebe von FHC-Patienten und Analyse der molekularen Mechanismen der allelischen Imbalance 

    Projektleitung: Montag, Judith (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Pich, Andreas (Prof. Dr.), Toxikologie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin; van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.), Vrije Universiteit Amsterdam, NL; Ho, Carolyn, Harvard Medical School, Brigham and Women's Hospital, Boston, USA; Förderung: DFG

      

    • Funktionelle Charakterisierung von Myofibrillen aus humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen von FHC-Patienten

    Projektleitung: Iorga, Bodgan (Prof. Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Brenner, Bernhard (Prof. Dr.);
    Kooperationspartner: Zweigerdt, Robert (Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Martin, Ulrich (Prof. Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Fischer, Martin (Dr.), Neurophysiologie, MHH; Wrede, Christoph (Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Hegermann, Jan (Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Förderung: DFG 

    • Employing single molecule investigation methods to gain detailed insights into regulatory light chain’s role in modulating myosin 2 heavy chain function

    Projektleitung: Amrute-Nayak, Mamta (Dr.); Kooperationspartner: Steffen, Walter (PD Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Chizhov, Igor (Dr.), Strukturbiochemie, MHH; Förderung: DFG

    • Funktionelle Charakterisierung von FHC-assoziierten Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne mittels des Aktinfilament-Gleitassays

     Projektleitung: Scholz, Tim (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Förderung: DFG

        

    • Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf mitotische Kinesinmoleküle 

    Projektleitung: Scholz, Tim (Dr.); Kooperationspartner: Kirschning, Andreas (Prof. Dr.), Institut für Organische Chemie, LUH; Schmidt, Christoph (Prof. Dr.), Georg-August-Universität Göttingen; Lakämper, Stefan (Dr.), ETH Zürich, CH; Sasse, Florenz (Dr.), HZI Braunschweig; Förderung: StrucMed, MHH

      

    • Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der optischen Falle

    Projektleitung: Steffen, Walter (Dr.); Kooperationspartner: Koonce, Michael (Dr.), Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Kon, Takahide (Prof. Dr.), Osaka University, JP; Förderung: DFG

      

    • Molekulare Grundlage der Funktionsweise von Myosin 2

    Projektleitung: Steffen, Walter (Dr.); Kooperationspartner: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Manstein, Dietmar, (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG