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Projektbereich B


DFGSFB 566
Zytokin-Rezeptoren und Zytokin-abhängige Signalwege
als therapeutische Zielstrukturen

Neben Zytokinen und deren Rezeptoren sind die verschiedenen Signalmechanismen, welche einerseits die Zytokinwirkung vermitteln und andererseits - direkt oder auch indirekt, z.B. über zelluläre Differenzierungsprozesses - zur Regulation der Zytokinbiosynthese beitragen können, von besonderem Interesse sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die therapeutische Intervention.

Das Teilprojekt B2 beschäftigt sich mit der Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen. Bei der Hämatopoese, wie auch bei der Entstehung von Leukämien, spielen Rezeptortyrosinkinasen vom Typ III wie c-Kit, Flt3, c-Fms (= M-CSF-Rezeptor) und PDGFRezeptor eine Schlüsselrolle. Diese sind strukturell eng miteinander verwandt. Die Aktivierung der Tyrosinkinase durch den spezifischen Wachstumsfaktor führt zur Phosphorylierung in verschiedenen Positionen, was zur Bindung von individuellen Signalmolekülen führt, die die spezifische Aufgabe eines bestimmten Rezeptors bei der Hämatopoese erklären konnten. Als neues Substrat von c-Fms wurde FMIP identifiziert, das auch mit einigen anderen Wachstumsfaktoren, nicht aber mit dem Stammzellfaktor c-Kit, interagiert. FMIP stellte sich als ein Mitglied des mRNA Exportkomplexes THO, FMIP/THOC5 heraus. Es interagiert mit weiteren Mitgliedern des Komplexes und einer Reihe von Translations-Initiationsfaktoren. Um seine Funktion zu studieren, wurden Überexpressions- und Knockout-Mäuse generiert. FMIP/THOC5-/--Mäuse waren embryonal letal. Daher wurde eine mit IFN induzierbare, konditionale FMIP-Knockout-Maus generiert, die nach poly(I:C)-Injektion eine deutliche Leukopenie und Anämie zeigen. Mit diesen experimentellen Modellen soll der über die Phosphorylierung von FMIP/THOC5 verlaufende Kontrollmechanismus des mRNA-Transports charakterisiert werden. Dabei sollen auch die Gene analysiert werden, deren Expression vom THO-Komplex reguliert wird.

Das Teilprojekt B7 untersuchte die Mechanismen der antitumoralen Aktivität von IRF-1, einem Transkriptionsfaktor, der an der Signaltransduktion von Interferonen und anderen Zytokinen beteiligt ist. IRF-1 aktiviert die Expression von Genen, die in zelluläre Prozesse wie Proliferation, Pathogenabwehr und Aktivierung von Immunreaktionen eingreifen. Eine Erhöhung der Expression von IRF-1 inhibiert das Zellwachstum und kann auch in malignen transformierten Zellen die Transformation revertieren. Dabei beeinflusst IRF-1 Gene, die an der Zellzyklusregulation beteiligt sind (Zyklin D1, cdk2, p27). Die beteiligten Mechanismen sollen analysiert werden. Schwerpunkt wird sein, mit globalen Expressionsanalysen die Mediatoren – v.a. Komponenten von Signaltransduktionswegen – zu identifizieren, die an der Übermittlung von IRF-1 auf Zellzyklusregulatoren beteiligt sind. Interferone sind definiert als Moleküle, die in Zellen Schutz vor Virusinfektionen vermitteln. Als neues Zielgen von IRF-1 konnte Vig-1 identifiziert werden, dessen Produkt Viperin antivirale Aktivität hervorruft. So hemmt seine Überexpression die Replikation von VSV unabhängig vom Typ I Interferonsystem. Aufbauend auf diese grundlegenden Befunde soll nun der IFN Typ Iunabhängige antivirale Weg aufgeklärt und die Rolle von IRF-1 analysiert werden. Die vorgeschlagenen Experimente könnten den Weg für einen therapeutischen Einsatz von IRF 1 bei Tumorerkrankungen und Virusinfektionen ebnen. Es ist heute allgemein akzeptiert, dass die Artherosklerose – die mit ihren Endpunkten Schlaganfall und Herzinfarkt zu den häufigsten Todesursachen gehört – eine chronisch entzündliche Erkrankung der Gefäßwand ist. Sie wird durch Wechselwirkung der Zellen der Gefäßwand mit in Blut zirkulierenden Entzündungszellen und Lipoproteinen ausgelöst und aufrechterhalten. In Teilprojekt B9 wird in Mausmodellen untersucht, welche Rolle dabei Akutphase-Reaktionen spielen, die von dem Ko-Rezeptormolekül gp130 abhängen. Dabei wurden vor allem Mausmodelle analysiert, die durch Kreuzung verschiedener konditionaler K.o.-Mutanten mit Mutanten generiert werden, in denen Artherosklerose auftritt (apoE-/-, LDL R- /-). Das Ausschalten von gp130 spezifisch in Hepatozyten blockiert die Freisetzung von Akutphase-Proteinen (z.B. Serumamyloid, dem Äquivalent von CRP in der Maus). Daraufhin durchgeführte genetische Analysen in Patientenpopulationen bestätigten auch im Menschen, dass SNPS im gp130-Gen mit einer erhöhten Inzidenz von Artherosklerose assoziiert wird. Daher soll die Bedeutung der gp130-abhängigen Akutphase-Reaktion detailliert für die Entstehung artherogener Prozesse analysiert werden. Dabei soll auch die Möglichkeit spezifischer therapeutischer Interventionen geprüft werden. Viren haben im Verlauf der Evolution Strategien entwickelt, die, soweit bekannt, mit allen Mechanismen und Signalwegen einer antiviralen Wirtsantwort interferieren können. Das Teilprojekt B11 beschäftigt sich mit dem Kaposi-Sarkom-assoziierten Herpes-Virus (KSHV = humanes Herpes-Virus 8), das die Ursache des Kaposi-Sarkoms wie auch mehrerer BLymphozyten- Neoplasien ist. Dabei persistiert das Virus in latenter Form in den betroffenen Zellen. Daneben spielen proinflammatorische Zytokine eine wichtige Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankungen, die durch die Expression viraler Gene induziert werden. So induziert das K15-Protein die zellulären Zytokine IL-8, IL-6, CCL2, CCL20, von denen z.B. IL-6 Bedeutung bei der frühen tumorassoziierten Angiogenese hat. K15 aktiviert über NIK den nichtkanonischen Weg der Aktivierung von NFκB bei der B-Zell-Differenzierung. Um die Rolle von K15 in der frühen Phase von Kaposi-Sarkom oder B-Leukämien analysieren zu können, wurde eine K15-Deletionsmutante hergestellt. Mit ihr als Werkzeug soll vor allem die KHSVinduzierte Angiogenese in in-vitro- und in-vivo-Modellen analysiert werden. Darüber hinaus soll der Mechanismus untersucht werden, durch den K15 den nicht-kanonischen NFκB-Weg aktiviert und dadurch die B-Lymphozyten-Differenzierung beeinflusst. Das Teilprojekt B12 ist in seiner Relevanz für die Therapie der chronischen Entzündung schon recht weit fortgeschritten. Die Deletion des Gens der Proteinkinase MK2 in der Maus hat einen deutlichen und dosisabhängigen (+/-,-/-) inhibitorischen Effekt auf Kollagen-induizierte Arthritis und die Hemmung der Proteinkinase(n) MK2 (und MK3) durch niedermolekulare ATPkompetitive Proteinkinaseinhibitoren in der Ratte hat positive Effekte auf den Verlauf von Staphylococcus Aureus induzierter Arthritis. Diese Effekte, die MK2 als Zielstruktur für die Entzündungstherapie weiter qualifizieren, sollen in weiteren Modellen erhärtet werden. Parallel dazu sollen die molekularen Mechanismen, auf welche Weise MK2 die LPS-induzierte Zytokinbiosynthese stimuliert, weiter untersucht werden. Hier wäre es möglich, dass MK2 sowohl transkriptionell als auch post-transkriptionell agiert. Da kürzlich weitere zelluläre Funktionen für die MKs in der Zellzyklusregulation, Kanzerogenese und Hämatopoese beschrieben wurden, soll untersucht werden, welche Nebenwirkungen MK2-Inhibitoren für diese Prozesse hervorrufen könnten. Das Teilprojekt B13 könnte ebenfalls bald praktische Relevanz für die Hemmung des Entzündungsmediators IL-8 erlangen. In diesem Teilprojekt wurde gezeigt, dass für die transkriptionelle Aktivierung des IL8-Gens die Interaktion von NF-κB und NRF (NF-kappaBrepressing factor) maßgeblich verantwortlich ist. Peptide, welche in der Lage sind die NF- κB/NRF-Interaktion selektiv in vitro zu inhibieren, konnten ebenfalls erfolgreich zur Inhibition der IL-8-Expression in HeLa-Zellen eingesetzt werden. Ausgehend von diesen Peptiden sollen in Zusammenarbeit mit und unter Nutzung der Ressourcen des HZI Peptidmimetika und niedermolekulare Inhibitoren für die Hemmung der NF-κB/NRF-Interaktion / IL-8 Expression entwickelt bzw. identifiziert werden. Weitere IL-8 spezifische Interaktionspartner der basalen Transkriptionmaschinerie sollen gesucht werden, um diesen methodischen Ansatz möglichst auszudehnen.

Im Zentrum der Untersuchungen des Teilprojektes B14 steht die Rolle des TGF-β verwandten Zytokins GDF-15 und des an der Zytokinrezeptor-Signaltransduktion beteiligten zentralen TAK1-Regulators TAB1 für Myokardinfarkt-assozierte Entzündungsprozesse, welche insbesondere beim Heilungsprozess und beim Remodeling nach Infarkt eine wichtige Rolle spielen. Es konnte gezeigt werden, dass das Zytokin GDF-15 nach myokardialer Ischämie- Reperfusion im Infarktareal vermehrt exprimiert wird, anti-apoptotische Effekte vermittelt und die Infarktgröße limitiert, und dass Stickstoffmonoxid (NO) während Ischämie-Reperfusion die TAB1-induzierte p38 MAPK Autoaktivierung im Kardiomyozyten hemmt und ebenfalls antiapoptotische Effekte vermittelt. Diese Effekte sollen nun durch einen Kardiomyozytenspezifischen knock-out von TAB1 und GDF-15 knock-out Mäuse verifiziert werden. Gleichzeitig sollen die downstream-targets von GDF-15 und dessen Rolle als Biomarker für kardiovaskulären Erkrankungen weiter charakterisiert werden. In Vorarbeiten zum Teilprojekt B15 wurde das endosomale Adapterprotein p14 als verantwortlich für eine p14-MP1-MEK1-Wechselwirkung an späten Endosomen und entsprechende Modulation des Endosomentransportes und des intrazellulären MAPK-Signallings charakterisiert. Patienten mit reduziertem p14 zeigen Defekte im B-Zell und T-Zell- Kompartiment sowie in der Homöostase myeloider Zellen. Basierend auf diesen Daten soll die Hypothese untersucht werden, ob p14 eine entscheidende Rolle in multiplen Zytokinrezeptorabhängigen Signalwegen spielt. Ein entsprechendes konditionales Knockout-Mausmodell soll dazu dienen, die Mechanismen der p14-abhängigen Hämatopoese sowie der räumlich/zeitlichen Kontrolle der endosomal-vermittelten Zytokinrezeptor-Signaltransduktion zu studieren. Erste Hinweise auf einen Einfluss von p14 auf die Hämatopoese sowie die TNF-Produktion von dendritischen Zellen scheinen hier besonders interessant.

Das Teilprojekt B16 hat die modulatorische Rolle verschiedener Isoformen der Proteinkinase C auf die Signaltransduktion des Zytokins TGF-β in Podozyten bei der diabetischen Nephropathie zum Gegenstand. Beim Diabetes mellitus ändert sich das glomeruläre Mikromilieu und es kommt zu Hyperglykämie sowie zur erhöhter Expression von TGF-β. Beide Stimuli führen am Podozyten zu pro-apoptotischem Signalling und vermehrtem Zelltod. Im Mausmodell wirkt kann sich das Fehlen bestimmten Isoformen der PKC – je nach Isoform - sowohl positiv als auch negativ auf den Verlauf der diabetischen Glomerulopathie auswirken, ohne dass die spezifische Rolle der PKC-Isoformen in Podozyten bisher erfasst wurde. Deshalb soll in diesem Teilprojekt der Effekt einer verminderten oder vermehrten Expression der Isoenzyme PKCα, PKCδ, PKCε und PKCι auf Signaltransduktionskaskaden nach TGF-β- und Glukose- Stimulation und auf das apoptotische Verhalten der Zellen untersucht werden. Ergebnisse aus diesen Untersuchungen könnten zu neuen „podozyten-protektiven“ Strategien führen, die durch gezielte Stimulation oder Blockade einzelner Isoformen den Beginn und die Progression einer diabetischen Nephropathie hinauszögern können. Wie in den Teilprojekten B2, B9, B12-B15 ist auch in Teilprojekt B16 die Analyse entsprechender knockout-Mäuse und –Zellen vorgesehen.

Der Verlust der Empfindlichkeit bei wiederholter Stimulation mit demselben Stimulus wird als Toleranz bezeichnet und bei Sepsis als Schutzmechanismus bzw. Paralyse der Zelle betrachtet. Ziel des Teilprojektes B17 ist die systematische Aufklärung der molekularen Mechanismen der TNF-Toleranz sowie deren zelluläre Auswirkungen. Dabei soll insbesondere die Beteiligung weiterer Proteine an diesem Toleranzphänomen mittels Array-basierter Genexpressions- sowie Proteomanalyse untersucht werden. Basierend auf diesen Daten werden die bei Toleranz beteiligten Mechanismen der Signalübertragung und Genregulation sowie die Funktionalität betroffener Zellen, z.B. immunologische oder basale zelluläre Prozesse, charakterisiert. In einem diagnostischen Ansatz sollen Toleranzphänomene unter Verwendung von Monozyten von Sepsispatienten im Zustand der Immunparalyse analysiert werden. Ein besseres Verständnis der TNF-Toleranz könnte Ansatzpunkte liefern, die Immunparalyse bei Sepsis diagnostisch besser zu erfassen und spezifisch zu therapieren.