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Wenn Proteine fliegen

 

 

Massenspektrometrische Proteinanalytik

 

Proteine sind die Moleküle einer Zelle auf die es ankommt: sie geben Struktur, bewerkstelligen den Stoffwechsel, regeln Entwicklungsprozesse und reagieren auf Reize und Botenstoffe – die DNA ist lediglich Informationsträger ohne strukturelle oder katalytische Funktion. Die Analyse der Proteine und die Aufklärung ihres Zusammenspiels führt zu einem besseren Verständnis der zellulären Abläufe und eröffnet neue Möglichkeiten zur Diagnose und Therapie von Erkrankungen. In der Proteinanalytik haben sich massenspektrometrische Techniken in den letzten Jahren zu einem wertvollem Instrument entwickelt, mit der Proteine identifiziert und ihre Strukturen aufgeklärt werden können.

Massenspektrometer bestehen grundsätzlich aus zwei Teilen. Einer Ionenquelle und einem Massenanalysator. In der Ionenquelle werden die Proteine zum Fliegen gebracht. Sie werden durch die Aufnahme eines Protons ionisiert und lassen sich so in die Gasphase überführen. Die Massen der ionisierten Proteine können anschließend im Massenanalysator genauestens bestimmt werden. Da auf der Erde die Masse einer Substanz ihrem Gewicht entspricht, werden die Proteine folglich gewogen.

 

Techniken mit denen Proteine schonend ionisiert und damit zum Fliegen angeregt werden, stellen den Durchbruch zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen dar. Vor ca. 15 Jahren wurden diese Methoden erstmalig beschrieben und Erfinder und Technik durch die Verleihung des Nobelpreises für Chemie 2002 gewürdigt. Zum einen können Proteine eingebettet in einer Matrix aus Zimtsäure mittels Laserimpuls ionisiert werden, so dass sie in die Gasphase übertreten und fliegen. Dieses Verfahren nennt man matrix assisted laser desoprtion ionisation (MALDI). Zum anderen können gelöste Proteine in ein starkes elektrisches Feld gesprüht werden, was als Electrospray-Ionisierung (ESI) bezeichnet wird. Durch hohe Temperaturen wird das Lösungsmittel komplett verdampft, die ionisierten Proteine bleiben zurück und fliegen durch elektrische Felder geleitet in den Massensanalysator.

 

Massenanalysatoren funktionieren nach verschiedenen Prinzipien. Ein einfach aufgebauter Analysator ist der Flugzeitmassenanalysator (TOF= time of flight). Darin werden die fliegenden Proteine beschleunigt und im Hochvakuum über eine Messstrecke von ca. 1-3 m gejagt. Anhand der Flugzeit kann die exakte Größe der Proteine berechnet werden. Es werden Geschwindigkeiten von 10.000 m/s und mehr erreicht, trotzdem ist diese Messung äußerst genau. Üblicherweise koppelt man die Ionisierungstechnik MALDI mit einem oder auch zwei hintereinander geschalteten Flugzeitmassenspektrometern, die man als MALDI-TOF- bzw. MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer bezeichnet.

 

Ein weiterer Massenanalysator ist die Ionenfalle. Sie ist im Vergleich zu einem TOF-Analysator recht klein (10 cm Durchmesser vs 1-3 m Länge). Eine Ionenfalle kann fliegende ionisierte Proteine einfangen und sammeln. Nach kompletter Füllung wirft sie die Proteine sortiert nach Größe wieder hinaus, so dass die Massen sehr genau bestimmt werden. Füllung und sortiertes Auswerfen dauert ca. 200 ms. Idealerweise wird ein Ionenfallen-Massenspektrometer mit einer Elektrospray-Ionisierung verbunden und die Geräte als ESI-IT Massenspektrometer bezeichnet.

 

Moderne Massenspektrometer können die Massen von Proteinen und Peptiden auf wenige ppm genau bestimmen und verfügen über eine sehr hohe Empfindlichkeit. Ein Peptid mit einer Masse von 10.000 Da kann auf +/- 0.05 Da genau gemessen werden. Dabei reicht es idealerweise aus, wenn nur 1 femtomol (10-15 mol = 10-12 g) des Peptides vorliegt.

 

Zur Identifizierung und Analyse eines Proteins im Massenspektrometer enthält in der Regel eine Coomassie-gefärbte einzelne Bande im SDS-Gel genügend Material. Das Protein wird direkt im Gel (oder auch in Lösung) mit einer Protease in kleinere Untereinheiten, die Peptide, gespalten. Dies ist zur Probenvorbereitung nötig, da Massenspektrometer kleinere Moleküle deutlich sensitiver messen können. Nach der Messung erhält man einen Peptidmassen-Fingerabdruck (PMF) der idealer weise alle Peptide eines Proteins umfasst und dadurch sehr spezifisch ist. In Datenbanken kann dann das zu dem Peptidmassen-Fingerabdruck passende Protein gefunden werden. Im Vergleich mit der DNA-kodierten Sequenz lassen sich posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierungen und Glykosylierungen nachweisen. Die Phosphorylierung eines Proteins kann durch den Nachweis eines exakt 80 Da größeren Peptides gezeigt werden. Genauere Daten oder eine „de novo“-Sequenzierung eines Proteins erhält man durch MS/MS-Techniken. Massenspektrometer, die diese Messungen durchführen können, verfügen über zwei miteinander gekoppelte Massenanalysatoren. Dabei funktioniert der erste Massenanalysator als Massenfilter mit dem eine bestimmte Masse isoliert wird. Dieses selektierte Molekül wird durch den Zusatz eines Stoßgases (z.B. Helium) zertrümmert und die Größe der Bruchstücke in einem zweiten Massenspektrometer bestimmt. Glücklicherweise zerbricht ein Peptid oder Protein am leichtesten am Peptidrückgrat. Stellt man also Bedingungen ein, unter denen jedes Molekül statistisch nur einmal zerbricht, so erhält man eine „Massenleiter“ aus mehreren Signalen, deren Abstände immer genau mit der Masse der entsprechenden Aminosäuren korrelieren. So kann die Sequenz eines unbekannten Peptids ermittelt werden.