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Prof. Dr. Bigalke

 

 

Rezeptorvermittelter, transmembranärer Transport von Tetanustoxin

 

  • Domänenstruktur der clostridialen Neurotoxine
  • Untersuchung der Toxinaufnahme am Modellsystem "Chromaffine Zellen"

 

 

  • Einsatz rekombinanter Toxinfragmente zum Studium der Toxinaufnahme

 

 

 

Domänenstruktur der clostridialen Neurotoxine

 

Tetanustoxin (TeNT) und die Botulinumneurotoxine der Typen A - G (BoNT/A-G) werden von peripheren Nervenenden aufgenommen. Nur dort erkennen die Toxine Rezeptoren, an welche sie binden. Die Toxine bestehen aus einer Protease - der leichten Kette (L) - und einem Transportteil - der schweren Kette (H). Im Transportteil sind mehrere, für die Membrangängigkeit benötigte Domänen enthalten. Eine dieser Domänen, die aus den C-terminalständigen 34 Aminosäuren besteht (HC 1 - 34), soll an ein Gangliosid binden und eine zweite, nicht näher definierte Struktur an ein Protein. Ein aus ca. 400 Aminosäuren zusammengesetztes Fragment, welches zwischen dem Enzym und den Teilen mit den Bindungsstellen liegt (HN), enthält eine helical angeordnete Aminosäurensequenz, deren Konformation sich pH-abhängig verändert. Dieses Fragment soll für die Translokation aus dem sauren Endosom, in welches die Toxine nach rezeptorvermittelter Endozytose gelangen, in das Zytosol verantwortlich sein. Im Zytosol wird das jeweilige Enzym enzymatisch von seinem Transportteil abgetrennt. Die Spaltung entspricht einer Aktivierung durch Reduktion, denn nur die freien, nicht mit dem Transportteil verknüpften Enzyme sind wirksam.

 

Untersuchung der Toxinaufnahme am Modellsystem "Chromaffine Zellen"

 

Im unserer Arbeitsgruppe untersuchen wir am Modell chromaffiner Zellen die Aufnahme clostridialer Neurotoxine. Diese Zellen sind unempfindlich für clostridiale Neurotoxine, obwohl deren Substrate intrazellulär enthalten sind, denn diesem Zelltyp fehlen plasmamembranständige Bindungsstellen. Zumindest toxinspezifische Ganglioside kommen in der Plasmamembran chromaffiner Zellen nicht vor. Bestückt man die Plasmamembran chromaffiner Zellen mit toxinbindenden Gangliosiden, werden auch sie sensitiv für die Neurotoxine, und infolge einer Vergiftung wird die stimulierte Hormonsekretion unterbrochen. Der Block der Hormonsekretion kann als Marker für eine Passage des Toxins durch die Plasmamembran verwendet werden. Werden chromaffine Zellen in einem sauren Milieu (pH 5) in Gegenwart von TeNT inkubiert, gelangt das Toxin ebenfalls in das Zytosol, denn es blockiert auch unter diesen Bedingungen die Freisetzung von Noradrenalin. Der Effekt kann verstärkt werden, wenn die Zellen vorher mit dem toxinbindenden Gangliosid beladen wurden. Obwohl die enzymatische Aktivität selbst kaum temperaturabhängig ist (zwischen 25° und 37° C), kann ein Sekretionsblock bei 25° C nicht erreicht werden. Dies bedeutet, dass die Membranpassage oder die enzymatische Aktivierung des Enzyms bei niedrigen Temperaturen nicht stattfindet.

 

Einsatz rekombinanter Toxinfragmente zum Studium der Toxinaufnahme

 

Die Freisetzung von Noradrenalin kann ebenfalls verhindert werden, wenn eine rekombinante HNL-Mutante dem Toxin beigemischt wird, in der das Enzym durch Veränderung in seinem aktiven Zentrum inaktiv ist. Da das mutierte Enzym die aktive Form nicht vom Substrat verdrängt (getestet in einem in vitro-Versuch auf Proteinbasis), muss eine Verdrängung entweder am toxinreduzierenden und damit aktivierenden Enzym stattfinden oder die Verdrängung findet auf einem noch nicht klassifizierten Rezeptor schon auf der Plasmamembran statt. Durch Experimente mit rekombinanter HNL, in der L aktiv war, konnten wir eine intrazelluläre Verdrängung am aktivierenden Enzym ausschließen, denn auch dieses Fragment unterdrückt die sekretionshemmende Wirkung von TeNT. Somit muss die Verdrängung schon auf der Plasmamembran stattfinden. Da dem HN die gangliosidbindende Domäne fehlt, konkurrieren TeNT und HN um eine bisher unbekannte Bindungsstelle, die vom Toxin nur im sauren Milieu erkannt wird, denn bei einem pH von 7.4 gelangt das Toxin nicht in die Zelle. Im Gegensatz zur Wirkung von TeNT wird die Wirkung von BoNT/A durch HNL aus TeNT nicht verhindert. Aus den Resultaten schließen wir, dass eine HN-sättigbare Bindungsstelle an der Translokation von TeNT beteiligt ist. Diese Bindungsstelle ist verschieden von neuronalen TeNT-Rezeptoren, an die das Toxin auch bei physiologischen Wasserstoffionen-Konzentrationen bindet. Wir postulieren, dass diese Bindungsstelle in saure Endosomen für TeNT zugänglich wird. Da BoNT/A an diese Stelle nicht bindet, könnte sie verantwortlich für die unterschiedlichen Wege der Toxine im Organismus sein.