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A2: Lasergestützte Transfektion von Stammzellen


Nolte, Ingo, Prof. Dr. med. vet., deutsch

(07/2007 – 06/2011)

Klinik für Kleintiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

Murua Escobar, Hugo, PD Dr. rer. nat., deutsch

(07/2011 – 07/2012)

Klinik für Kleintiere

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

 

Lubatschowski, Holger, Prof. Dr. rer. nat., deutsch

(07/2007 – 06/2010)

Laser Zentrum Hannover e.V.

 

Heisterkamp, Alexander, Prof. Dr. rer. nat., deutsch

(07/2007 – 06/2012)

Friedrich-Schiller-Universität Jena

Institut für Angewandte Optik

 

Junghanß, Christian, Prof. Dr. med., deutsch

(07/2007 – 07/2012)

Zentrum für Innere Medizin, Klinik III, Hämatologie/Onkologie/Paliativmedizin

Universität Rostock


 

Im Rahmen des Teilprojekts A2 sollten mittels hocheffizienter Femtosekunden (fs)-Lasertechnolgie canine hämatopoetische Stammzellen mit dem proteincodierenden Bereich des caninen Gens für das High Mobility Group Box 1 (HMGB1) Protein transfiziert und zu HMGB1-exprimierenden dendritischen Zellen (DZ) differenziert werden. Das Expansionsverhalten, die immunstimulatorische Potenz sowie das in vivo Migrationsverhalten der transfizierten DZ sollten charakterisiert werden und anschließend der Einsatz der HMGB1 exprimierenden caninen DZ als Vakzine im Großtiermodell Hund erfolgen. Im Rahmen des Projektes wurden verschiedene eukaryotische DNA-Expressionsvektoren hergestellt, die das canine HMGB1 Protein (cHMGB1), als grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Fusionstranskript, sowie als HMGB1 und GFP IRES Konstrukt codieren. Die generierten Vektoren wurden neben der fs-laservermittelten Transfektion (Optoporation) für weitere Transfektionsversuche genutzt. Hierbei wurde u.a. auf -im TR37 generiertelaserabladierte Goldnanopartikel zurückgegriffen und deren Einfluss auf Vektorfunktionalität und Transfektionseffizienz analysiert. Zur Optoporation in verschiedene eukaryotische Zelltypen wurden rekombinante sowie nicht-rekombinante Vektoren eingesetzt. Um anschließend eine Erhöhung der transfizierten Zellzahlen zu erreichen, wurden zwei verschiedene Ansätze, auf Basis von Mikrofluidik in Kombination mit Laserfallen und auf Basis einer Nanopartikel-vermittelten Laserperforation, entwickelt. Canine hämatopoetische Stammzellen wurden erfolgreich mit den klonierten rekombinanten Expressionsvektoren transfiziert. Am effektivsten stellt sich zu diesem Zeitpunkt die Nanopartikel-vermittelte Lasertransfektion dar. Im letzten Jahr konnte ein automatisierter Aufbau zur Hochdurchsatztransfektion realisiert werden, mit dem hohe Zellzahlen (>4 Mill. Zellen) in vertretbarer Zeit automatisiert bearbeitet werden können. Unter Verwendung optimierter Prozessparameter wurden hier mit 10kDa Dextranen und siRNA Perforationseffizienzen größer 80% bei sehr geringer Zelltoxizität erreicht. Migrationsstudien im Hund demonstrierten eine Abhängigkeit der DZ-Migration von der Art der Applikation. Die Applikationsform könnte damit einen Einfluss auf die Immunreaktion ausüben. Im caninen Modell des gemischten hämatopoetischen Chimärismus konnte durch Vakzinierung mit HMGB1-exprimierenden DZ keine Veränderung des Chimärismus erreicht werden, obwohl in vitro Modifikationen im Zytokinmuster caniner T-Zellen nach HMGB1-Exposition erkennbar waren.