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Forschungsbericht 2014

Forschungsberichte 2008 , 2009 , 2010 , 2011 , 2012 , 2013 , 2014 , 2015 , 2016

Allgemeine Informationen und Forschungsprofil der Abteilung



Unterschiede im zellulären Hypertrophie-Phänotyp zwischen Hypertropher Obstruktiver Kardiomyopathie und Aortenstenose



Die Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist durch linksventrikuläre Hypertrophie (LV-Wanddicke (IVS) >12mm) und ein erhöhtes Risiko für plötzlichen Herztod charakterisiert (Force et al., Circulation 2010; Ashrafian et al., Circ Res 2011). Oft ist bei der HCM ein myocyte-disarray und eine interstitielle Fibrose nachweisbar.
Die HCM stellt als häufigste genetisch bedingte Herzmuskelerkrankung zugleich die häufigste Ursache für plötzlichen Herztod bei Jugendlichen und jungen Erwachsenen dar. Die Prävalenz für HCM in der allgemeinen Bevölkerung ist ca. 0.2 % (bzw. 1:500). Klinisch ist HCM eine sehr heterogene Erkrankung, die vom benignen Verlauf ohne Symptome bis zum Vollbild einer Herzinsuffizienz reicht.
In ungefähr 25% der Fälle führt die Hypertrophie zu einer dynamischen Obstruktion des LV-Ausflusstrakts und infolgedessen zur Entwicklung eines Druckgradienten (Hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie, HOCM). Bei entsprechend hohen Druckgradienten kann eine transaortale subvalvuläre Myektomie (Morrow-Prozedur) durchgeführt werden, um den Druckgradienten zu reduzieren.



Als Ursache für die Erkrankung sind Mutationen in über 20 Proteinen des Sarkomers und über 900 individuelle Mutationen identifiziert worden (Ho et al., Circulation 2010). Über 75% dieser Mutationen sind in den Genen für Beta-kardiales Myosin (MYH7) und Myosin-bindendes Protein C (MYBPC3) zu finden. Trotz der inzwischen routinemäßig durchgeführten Genotypisierungen von HCM-Patienten werden die funktionellen Auswirkungen der Mutationen auf zellulärer und molekularer Ebene, sowie die Prozesse, die schließlich zum Krankheitsbild der HCM führen, bisher kaum verstanden. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass die typischen Merkmale der HCM letztlich Folgen funktioneller Auswirkungen der jeweiligen Mutation auf molekularer Ebene des Sarkomers sind. Als mögliche Auslöser einer HCM wurden beispielsweise ineffektiver Energieumsatz der Muskelzellen oder Veränderungen im intrazellulären Calcium-Haushalt diskutiert. HCM-assoziierte Mutationen sollen eine erhöhte Calcium-Sensitivität der Kardiomyozyten und so eine verstärkte Kontraktilität des Herzmuskels bewirken. Nicht wenige Daten auch aus unserem Labor stellen dieses Konzept in Frage



Hier untersuchten wir in einem DFG-geförderten Projekt den molekularen Phänotyp der Hypertrophie bei HOCM im Vergleich zu LV-Hypertrophie bei Aortenstenose (AoSt). Die Frage war, ob Hypertrophie des Myokards auf zellulärer Ebene immer einem ähnlichen Muster folgt, oder ob es für HOCM charakteristische Veränderungen gibt, die Rückschlüsse auf Mutationseffekte, auf eine gemeinsame FHC-Pathogenese oder therapeutische Ansatzpunkte erlauben. Zur Untersuchung dieser Fragen stand uns Myokardgewebe eines Kollektivs von 32 Patienten mit HOCM zur Verfügung, welches bei Myektomien entnommen wurde. Als Vergleichskollektiv wurde Myektomiegewebe von Patienten mit Aortenstenose (AoSt) sowie Gewebe aus dem Septum von nicht-transplantierten Donorherzen verwendet. Das Myektomiegewebe erlaubt uns die Analyse direkt im betroffenen Myokard ohne den Umweg über ein Modellsystem.



Ergebnisse und Diskussion


Es wurden funktionelle Untersuchungen sowie Gelanalysen zum Phosphorylierungsgrad von kardialem troponin I (cTnI), der regulatorischen leichten Myosinkette und des cMyBPC an Kardiomyozyten aus Herzgewebe von 5 Donoren, 9 Patienten mit Aortenstenose und 9 HOCM-Patienten (3 cMyBPC-Mutationen, 3 Myosin-Mutationen (Beta-MyHC), 1 Myomesin-Mutation und 2 ohne nachgewiesene Mutation) durchgeführt. Sämtliche Methoden (Abb. 1A, B, D) sind publiziert (Kraft T et al., JMCC 2013).



Die Calciumsensitivität (definiert als Calcium-Konzentration für halbmaximale Kraftentwicklung; pCa50) von Kardiomyozyten der HOCM-Patienten ist signifikant erhöht gegenüber Donor und auch höher (p=0.18) als bei AoSt (Abb. 1C). Es ist jedoch bekannt, dass Patienten unterschiedliche Phosphorylierungsgrade z.B. des cTnI aufweisen können, welche die Calciumsensitivität beeinflusst. Daher wurde die Phosphorylierung von Sarkomerproteinen in den Gewebeproben analysiert (Abb. 1D, E).



Die Gelanalysen zeigen, dass die Phosphorylierung von cMyBPC, cTnT, cTnI und der leichten Kette 2 des Myosins (MLC2) bei AoSt und HOCM nicht signifikant verschieden sind. D.h. beide Formen der Hypertrophie wirken sich gleichermaßen auf die Phosphorylierung dieser Proteine aus. Beide unterscheiden sich jedoch signifikant vom Donormyokard (außer cTnT für HOCM vs. Donor). Vor allem fallen beim Donormyokard die sehr hohe Phosphorylierung von cTnI und MLC2 auf, was auch die relativ geringe Calciumsensitivität der Donor-Kardiomyozyten erklärt. Ursache hierfür könnte die besondere Situation des Donors mit starker adrenerger Stimulation sein. Die höhere Calciumsensitivität bei HOCM gegenüber AoSt ist wohl vor allem durch die geringere (p=0.19) cTnI-Phosphorylierung bei HOCM bedingt.


Abb.1: (A) Einzelne Herzmuskelzelle in der Messapparatur und (B) Originalregistrierung der aktiven und passiven Kraftmessung an einer einzelnen Herzmuskelzelle. (C) Calciumsen-sitivität (pCa50) von Kardiomyozyten aus den verschiedenen Gewebeproben (* p<0.05). (D) Gelanalysen des Phosphorylierungsgrades der sarkomerischen Proteine und (E) zusammenge-fasste Auswertung aller Gewebeproben.

Da unterschiedliche Phosphorylierungsgrade spezifische Effekte bei HOCM überlagern können, wurde im Rahmen der Kontraktionsmessungen isolierter Kardiomyozyten PKA-abhängige Phosphorylierung durch Inkubation mit PKA für alle Zellen angeglichen. Dadurch wird vor allem die cTnI und cMyBPC-Phosphorylierung zwischen den Proben angeglichen und so mögliche Auswirkungen von Mutationen auf die Calciumempfindlichkeit sichtbar.

Abb. 2: (A) pCa50 und (D) maximale isometrische Kraftentwicklung (Fmax) von Kardiomyozyten aus den verschiedenen Gewebeproben nach PKA-Inkubation (*p<0.05 oder p<0.01). (B) und (C) pCa50 der Kardiomyozyten von HOCM-Patienten mit IVS> 25mm bzw. IVS<25mm. IVS bei AoSt war <25mm. (E) Fmax von Kardiomyozyten mit beta-Myosin-Mutation (MYH7) und (F) mit cMyBPC-Mutation (je n=3 Myektomien mit verschiedenen Mutationen).

Nach Vereinheitlichung des Phosphorylierungsgrades durch PKA zeigt sich, dass die Calciumsensitivität bei HOCM signifikant erniedrigt ist gegenüber AoSt und Donor (Abb. 2A). Dies deutet auf mutationsbedingte Veränderungen der Kardiomyozyten bei HOCM hin. Interessanterweise korreliert eine besonders ausgeprägte Reduktion der Calcium-Empfindlichkeit mit einer IVS-Dicke >25mm bei stark betroffenen HOCM-Patienten (Abb. 2B, C). Möglicherweise verursacht ein starker Mutationseffekt auch eine deutlichere Hypertrophie. Messungen der maximalen Kraftentwicklung (Fmax) ergaben im Mittel eine etwas reduzierte Kraftentwicklung für HOCM-Kardiomyozyten gegenüber AoSt (Abb. 2D) bei praktisch normalem Fmax für AoSt. Die Phosphorylierung mit PKA hatte keinen Einfluss auf Fmax. Betrachtet man die Daten getrennt nach mutiertem Protein, so zeigt sich eine signifikante Reduktion von Fmax für die Beta-MyHC-Mutationen (MYH7; Abb. 2E), im Gegensatz zu den cMyBPC-Mutationen (Abb. 2F). Ebenso war die maximale Kraft der Zellen von Patienten mit IVS ³ 25mm signifikant kleiner als bei AoSt.

Insgesamt zeigen die funktionellen Untersuchungen nach Angleichung der PKA-abhängigen Phosphorylierung, dass sich die Kardiomyozyten bei HOCM-bedingter Hypertrophie hinsichtlich der Calciumempfindlichkeit und der Kraftentwicklung von Kardiomyozyten bei AoSt und Donor unterscheiden, wobei auch der Schwergrad der Septumhypertrophie einen Einfluss zu haben scheint. Demgegenüber verhalten sich Kardiomyozyten von AoSt sehr ähnlich den Donor-Kardiomyozyten.

 

Um zu klären, ob bei H(O)CM häufig beobachtete morphologische Veränderungen ursächlich für die teilweise reduzierte Kraftentwicklung sein könnten, wurden licht- und elektronenmikroskopische Analysen der Gewebeproben durchgeführt. Die Bewertung ergab für HOCM nicht nur deutlich mehr interstitielle Fibrose und zelluläre sowie myofibrilläre Unordnung, sondern auch besonders auffallend starke morphologische Veränderungen der Z-Scheiben, der Glanzstreifen und Erweiterungen von T-Tubuli. Diese Abweichungen waren in einzelnen Myokardproben von AoSt auch zu erkennen, jedoch in weit geringerem Ausmaß. Eine Zusammenfassung der qualitativen Bewertung basierend auf einer Bewertung des Schweregrades der jeweiligen Veränderung von 0-3 ist in Abb.3A gezeigt.

Abb.3: (A) Bewertung des Schweregrads morphologischer Veränderungen (EM und LM) (Skala 0 für nicht vorhanden bis 3 für sehr ausgeprägt) und (B-C) Analyse der Expression verschiedener mi-RNAs in den Gewebeproben (Donor n=6; AoSt n=4; HOCM n=15).

Da gezeigt worden war, dass myokardiale Hypertrophie mit typischen Veränderungen der microRNA-Profile im Myokard einhergeht, untersuchen wir derzeit, ob es auch für die verschiedenen Formen der Hypertrophie bei AoSt und HOCM spezifische Veränderungen in der miR-Expression gibt (Abb. 3B und C). Erste Ergebnisse zeigen für miR-206 und andeutungsweise auch miR-499 eine sowohl bei AoSt als auch bei HOCM gleichermaßen veränderte Expression. Interessanterweise ist die im gesunden Myokard (Donor) nur äußerst gering exprimierte miR-206 bei AoSt und HOCM signifikant erhöht.

 

Zusammengefasst zeigen die funktionellen und morphologischen Untersuchungen, dass sich die ausgeprägte Septum-Hypertrophie bei HOCM nicht nur funktionell, sondern auch morphologisch von Hypertrophie bei AoSt unterscheidet. Auch bei AoSt zeigen sich strukturelle Veränderungen, jedoch sind die einzelnen Kardiomyozyten im Hinblick auf Kraftentwicklung und Calcium-Sensitivität mit Herzmuskelzellen aus Donorgewebe vergleichbar. Die Unterschiede bei HOCM sind vermutlich auf die in den Herzmuskelzellen bzw. im Sarkomer, der morphologischen und funktionellen Untereinheit der Zellen, selbst liegende Ursache für die Erkrankung zurückzuführen. Nach unserer Hypothese spielt eine ungleiche Expression des mutierten Proteins und daraus resultierende unterschiedliche Kontraktionseigenschaften von Zelle zu Zelle zumindest für Beta-MyHC-Mutationen eine zentrale Rolle für die Entstehung für H(O)CM. Die bei HOCM im Mittel reduzierte Calciumsensitivität ist Zeichen einer veränderten Funktion der Kardiomyozyten, die ihrerseits Ursache für die stärkeren morphologischen Veränderungen (EM und LM) sein könnte. Bei AoSt ist die Hypertrophie eine Reaktion aller Kardiomyozyten gleichermaßen auf die Druckbelastung, bei HOCM eher eine Reaktion auf die primär veränderte Funktion der einzelnen Herzmuskelzellen, die Druckbelastung entsteht mit/infolge der Septum-Hypertrophie.

 

Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Perrot, Andreas, Charité, Berlin; Thum, Thomas (Prof. Dr.), IMTTS, MHH; Mühlfeld , Christian (Prof. Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Schmidtke, Jörg (Prof. Dr.), Stuhrmann-Spangenberg, Manfred (Prof. Dr.), Keyser, Britta (Dr.), alle Institut f. Humangenetik, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), beide Hospital Clinic, Barcelona, E; Dos Remedios, Cris (Prof. Dr.), University of Sydney, Sydney, AUS; Förderung: DFG; StrucMed, MHH.

Weitere Forschungsprojekte



Einfluss von FHC-assoziierten Mutationen im Konverter des beta-kardialen Myosins auf die Molekülsteifheit. Messungen am individuellen Myosinmolekül mittels optischer Falle

Projektleiter: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.)

Kooperation: Steffen, Walter (PD Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH

Förderung: DFG; StrucMed, MHH



Hypertrophe obstruktive Kardiomyopathie: Genotypisierung und Charakterisierung des molekularen Phänotyps durch Untersuchungen an isolierten Kardiomyozyten aus Myektomiegewebe

Projektleiter: Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation: Perrot, Andreas, Charité, Berlin; Thum, Thomas (Prof. Dr.), IFB-Molekulare und Translationale Therapiestrategien, MHH; Mühlfeld , Christian (Prof. Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Schmidtke, Jörg (Prof. Dr.), Institut f. Humangenetik, MHH; Stuhrmann-Spangenberg, Manfred (Prof. Dr.), Institut f. Humangenetik, MHH; Keyser, Britta (Dr.), Institut f. Humangenetik, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Dos Remedios, Cris (Prof. Dr.), University of Sydney, Sydney, AUS; van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.), Vrije Universiteit Amsterdam, NL

Förderung: DFG; StrucMed, MHH



Funktionelle Auswirkungen von FHC-assoziierten Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne. Biomechanische Untersuchungen an einzelnen Muskelfasern aus M. soleus-Biopsien von FHC-Patienten

Projektleiter: Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation: Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin; Bauersachs, Johann (Prof. Dr.), Klinik für Kardiologie und Angiologie; Thum Thomas (Prof. Dr.), IFB-Molekulare und Translationale Therapiestrategien, MHH; Schmidtke, Jörg (Prof. Dr.), Institut f. Humangenetik, MHH; Stuhrmann-Spangenberg, Manfred (Prof. Dr.), Institut f. Humangenetik, MHH; McKenna, William J. (Prof. Dr.), The Heart Hospital, University College London, UK

Förderung: DFG



Funktionelle Charakterisierung von FHC-assoziierten Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne mittels des Aktinfilament-Gleitassays

Projektleiter: Scholz, Tim (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Förderung: DFG



Single molecule studies on beta-cardiac myosin heavy chain mutations linked to hypertrophic cardiomyopathy (HCM) in humans

Projektleiter: Amrute-Nayak, Mamta (Dr.)

Förderung: HiLF, MHH



Funktionelle Charakterisierung von Myofibrillen aus Myektomieproben bei hypertrophisch obstruktiver Form der FHC

Projektleiter: Iorga, Bodgan (Jr. Prof. Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Brenner, Bernhard (Prof. Dr.)

Kooperation: Perrot, Andreas, Charité, Berlin

Förderung: DFG



Contraction kinetics of myofibrils isolated from M. soleus biopsies or myocardium (myectomies, explanted hearts) of FHC-patients with missense mutations in the cardiac myosin head Domain

Projektleiter: Iorga, Bodgan (Jr. Prof. Dr.)

Kooperation: Kraft, Theresia (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E

Förderung: DFG



Relative Quantifizierung des Anteils an wildtyp – und mutiertem beta-kardialem Myosin auf mRNA und Protein-Ebene in Myokardgewebe und M. Soleus - Biopsien von FHC-Patienten

Projektleiter: Montag, Judith (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation: Pich, Andreas (Prof. Dr.), Toxikologie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin; van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.), Vrije Universiteit Amsterdam, NL

Förderung: DFG; StrucMed, MHH



Expressionsanalyse mutierter beta-Myosin-mRNA in einzelnen, laser-mikrodissektierten Kardiomyozyten aus Gewebe von Patienten mit Familiärer Hypertropher Kardiomyopathie (single-cell-level allelic imbalance)

Projektleiter: Montag, Judith (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation: Wissel, Kristen (Dr.), HNO-Klinik, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin

Förderung: HiLF, MHH; StrucMed, MHH



Analyse der molekularen Mechanismen der allelischen Imbalance in Myokardgewebe bei FHC

Projektleiter: Montag, Judith (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Förderung: StrucMed, MHH



Kardiomyozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen als in vitro Modell der Familiären Hypertrophen Kardiomyopathie

Projektleiter: Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation: Zweigerdt, Robert (Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Martin, Ulrich (Prof. Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Fischer, Martin (Dr.), Neurophysiologie, MHH; Wrede, Christoph (Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Hegermann, Jan (Dr.), Institut für Anatomie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E

Förderung: DFG; StrucMed, MHH



Contraction kinetics and calcium sensitivity of cardiomyocytes derived from fibroblasts of FHC-patients with myosin mutations via human induced pluripotent stem cells

Projektleiter: Iorga, Bodgan (Jr. Prof. Dr.)

Kooperation: Kraft, Theresia (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Martin, Ulrich (Prof. Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Zweigerdt, Robert (Dr.), HTTG Chirurgie, MHH; Francino, Antonio (Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, E

Förderung: DFG



Generierung eines knock-in FHC-Schweinemodells mit Punktmutation im beta-kardialen Myosin zur Charakterisierung der Pathogenese der FHC

Projektleiter: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Montag, Judith (Dr.)

Kooperation: Niemann, Heiner (Prof. Dr.), FLI Mariensee; Petersen, Björn (Dr.), FLI Mariensee

Förderung: REBIRTH (DFG)



Charakterisierung von Veränderungen der Kontraktionseigenschaften und Calcium-Transienten isolierter Kardiomyozyten bei Hypertrophie-Entwicklung von Mäusen mit muscle RING finger (MuRF) Protein-knock-out

Projektleiter: Geers-Knörr, Cornelia (Dr.); Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation: Fielitz, Jens (Prof. Dr.), Charité, MDC, Berlin

Förderung: DFG



Zelluläre Verteilungsmechanismen des mit der Alzheimer-Krankheit assoziierten Tau Proteins und seine Auswirkungen auf die Kinesin-Funktion

Projektleiter: Scholz, Tim (Dr.)

Kooperation: Mandelkow, Eckhard (Prof. Dr.), DZNE und CAESAR Institut, Bonn; van Ham, Marco (Dr.), HZI Braunschweig; Walter, Wilhelm (Prof. Dr.), Universität Hamburg

Förderung: StrucMed, MHH



Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf mitotische Kinesinmoleküle

Projektleiter: Scholz, Tim (Dr.)

Kooperation: Kirschning, Andreas (Prof. Dr.), Institut für Organische Chemie, LUH; Schmidt, Christoph (Prof. Dr.), Georg-August-Universität Göttingen; Lakämper, Stefan (Dr.), ETH Zürich, CH; Sasse, Florenz (Dr.), HZI Braunschweig

Förderung: StrucMed, MHH



Klasse 1 Myosine als Regulatoren von Mikrotubulidynamik und Kinesinfunktion

Projektleiter: Scholz, Tim (Dr.)

Kooperation: Tsiavaliaris, Georgios (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH

Förderung: DFG



Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der optischen Falle

Projektleiter: Steffen, Walter (Dr.)

Kooperation: Koonce, Michael (Dr.), Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Kon, Takahide (Prof. Dr.), Osaka University, JP

Förderung: DFG



Molekulare Grundlage der Funktionsweise von Myosin 2

Projektleiter: Steffen, Walter (Dr.)

Kooperation: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Manstein, Dietmar, (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Chantler, Peter (Prof. Dr.), Royal Veterinary School, London, UK

Förderung: DFG



3D Rekonstruktion der Motordomäne des muskulären Myosins

Projektleiter: Hodgkinson, Julie Lynne (Dr.)

Kooperation: Morris, Edward (Dr.), The Institute of Cancer Research, London, UK

Förderung: Keine