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Zusammenfassung TP 1

 

Die dreidimensionale Struktur der ß-Untereinheit spannungsabhängiger Kalziumkanäle und ihre Interaktion

 

Spannungsabhängige Kalziumkanäle sind der wichtigste Transportweg für Kalzium in erregbaren Zellen. Diese Kanäle sind Proteinkomplexe aus mindestens drei nicht-homologen Untereinheiten, einer poren-bildenden α1-Untereinheit und den akzessorischen ß- und α2δ- Untereinheiten. Von den akzessorischen Untereinheiten ist die Wirkung der ß-Untereinheit am eindrucksvollsten. Die Bindung der ß-Untereinheit an die α1-Untereinheit fördert den Einbau des Kanals in die oberflächliche Zellmembran und verändert seine Funktion. Zwei konservierte für die Assoziation von α1- und ß-Untereinheit notwendige Aminosäuresequenzen wurden in der Vergangenheit identifiziert, die "α1-subunit interaction domain” (AID) und die “ß-subunit interaktion domain" (BID). Es ist zur Zeit allerdings noch nicht bekannt, ob die Interaktion dieser Sequenzen für beide Wirkungen der ß-Untereinheit ausreicht. Das Ziel unseres Forschungsantrages ist, die Wirkung von ß-Untereinheiten auf schon in der oberflächlichen Membran vorliegende Kalziumkanäle mit elektrophysiologischen Techniken zu untersuchen, und eine hochauflösende dreidimensionale Struktur der ß-Untereinheit zu bestimmen. Wir werden mittels Röntgenkristallanalyse die Atomstruktur von trunkierten Versionen sowie der vollständigen Sequenzen dreier ß-Untereinheiten Isoformen (65 – 71 kDa, ß1b, ß2a und ß2b) die wir in unserem Labor bereits in ausreichenden Mengen produzieren und bis zu Konzentration von 6 mg/ml konzentrieren können. Außerdem planen wir, Komplexe zwischen der AID Sequenz und ß-Untereinheiten zu kristallisieren. Als komplementären experimentellen Zugang werden wir die NMR Spektroskopie einsetzen, um die dreidimensionale Struktur von Domänen der ß-Untereinheit (17-28 kDa) zu untersuchen, die durch limitierende Proteolyse aus ß-Untereinheiten bestimmt wurden.