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Forschungsbericht 2011

Forschungsberichte 2008 , 2009 , 2010 , 2011 , 2012 , 2013 , 2014 , 2015 , 2016

Im Zentrum der wissenschaftlichen Interessen des Instituts stehen die molekularen Grundlagen von Bewegungs- und Transportprozessen im menschlichen Organismus, sowie Erkrankungen durch Mutationen in den für diese Bewegungsprozesse verantwortlichen Motorproteinen.

 

Zu solchen Bewegungsprozessen gehören der intrazelluläre Transport, Formänderungen von Zellen sowie die Fortbewegung von Zellen und Organismen. Diese vielfältigen Funktionen werden von drei Motorproteinfamilien erfüllt, den Myosinen, die mit Aktinfilamenten interagieren, den Kinesinen und Dyneinen. Letztere erzeugen Kräfte und Bewegungen im Zusammenspiel mit Mikrotubuli. Motorproteine können als Einzelmoleküle agieren, wie etwa beim Transport von Vesikeln, oder sind in komplexen Strukturen wie Myofibrillen oder Flagellen organisiert, um im Zusammenspiel makroskopische Kräfte und Bewegungen zu erzeugen. Durch eine Vielzahl von Erkrankungen wird die Relevanz der Motorproteine verdeutlicht. Diese Erkrankungen sind durch Veränderungen in den Motorproteinen selbst oder in modulierenden Proteinen verursacht.

 

 

Beispiele sind die Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie (HCM oder FHC), degenerative Erkrankungen der Motoneurone, die Alzheimer-Demenz oder die Metastasierung von Tumoren. Ziele der Forschungsprojekte sind einerseits die molekularen Grundprinzipien der Erzeugung von Kräften und Bewegungen mittels struktureller Umlagerungen in den Motorproteinen, sowie deren Koppelung an die Hydrolyse von ATP. Ein weiteres Ziel ist aufzuklären, wie Mutationen in Motorproteinen über veränderte Funktion zu Krankheitsbildern wie der familiären hypertrophischen Kardiomyopathie führen. Darüber hinaus erlauben primäre funktionelle Auswirkungen solcher Mutationen Rückschlüsse auf die funktionelle Relevanz einzelner Strukturelemente der Motorproteine. Durch Einführen gezielter Veränderungen und Expression veränderten Motorproteine in geeigneten Expressionssystemen, z.B. E. coli, Dictyostelium discoideum oder Insektenzellen, kann die funktionelle Bedeutung der einzelnen Strukturelemente systematisch aufgeklärt werden. Andererseits können die primären funktionellen Auswirkungen angeborener Mutationen genutzt werden, um Ansatzpunkte für korrigierende pharmakologische Beeinflussung der primären Funktionsstörungen und des resultierenden Krankheitsbildes zu identifizieren. Um diesen Zielen näher zu kommen haben wir im Jahr 2011 zwei neue Projekte initiiert. In Kooperation mit Heiner Niemann, Institut für Nutztiergenetik am FLI Mariensee, haben wir begonnen ein Grosstiermodell (Schwein) mit einer von uns untersuchten FHC-Mutation in der Kopfdomäne des kardialen Myosins zu etablieren. Dies wird erlauben, die völlig unklare Entwicklung des FHC-Phänotyps systematisch aufzuklären.

 

 

Darüber hinaus haben wir in Kooperation mit Ulrich Martin und Robert Zweigerdt (LEBAO) begonnen aus Hautfibroblasten von FHC-Patienten, über induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), Kardiomyozyten zu generieren. Unser Ziel ist über ein solches "Zellmodell" einerseits primäre funktionelle Veränderungen auch ohne skelettmuskuläre und myokardiale Biopsien betroffener Patienten charakterisieren zu können, andererseits, als möglichen innovativen therapeutischen Ansatz, die Mechanismen der ungleichen Expression von Wildtyp- und mutiertem Myosin sowie Wege zur Unterdrückung der Expression mutierten Myosins zu eruieren. Für diese Ziele haben wir weitere notwendige Methoden etabliert, um an kleinsten Proben, z.B. Myofibrillen, oder direkt am Einzelmolekül mittels Laserfalle und TIRF-Mikroskopie auch über iPSC-Kardiomyozyten funktionelle Auswirkungen von FHC-Mutationen erkennen und charakterisieren zu können.




Titel: Familial Hypertrophic Cardiomyopathy: Mutation effects and secondary adaptations in cardiomyocytes

Leitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.)

Kooperation:van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.) VU Amsterdam, NL; Stienen, Ger (Prof. Dr.) VU Amsterdam, NL; Francino, Antonio (Dr.) Hospital Clinic Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francino (Prof. Dr.) Hospital Clinic Barcelona, E; Dos Remedios, Christobal, Univ. Sydney, AUS; Brandis, Almuth (Dr.) Institut für Pathologie, MHH

Foerderung: MHH, DFG




Forschungsprojekt-Beschreibung


Familial Hypertrophic Cardiomyopathy (FHC) is the most frequent genetically transmitted cardiac disease with a prevalence of 1:500. It is often characterized by asymmetric hypertrophy of the left ventricular (LV) wall and the interventricular septum and by an increased risk for sudden cardiac death particularly in young adults. Myocyte disarray and interstitial fibrosis are hallmarks of FHC. Nearly all genotyped FHC cases revealed mutations in sarcomeric proteins. Yet, the underlying mechanisms initiating disease development and adaptational processes of the myocardium are still largely unknown. To investigate the mechanisms triggering FHC pathogenesis we focused on mutations in the β-cardiac myosin heavy chain (β-MyHC) gene (MYH7). MYH7 mutations are responsible for approximately 30-40% of all genotyped FHC cases. The β-MyHC isoform is expressed in ventricular myocardium and in slow-twitch skeletal muscle fibers and we previously focused on studying functional effects of different β-MyHC-missense mutations in slow-twitch fibers of M. soleus which we obtained from FHC patients. Data on functional effects or adaptations in human ventricular myocardium with FHC-related β-MyHC-mutations, however, are scarce. For us, a unique opportunity opened up for a direct comparison of effects on myocardium vs. slow twitch skeletal muscle when two severely affected FHC patients carrying β-MyHC-mutation R723G (MyHC723) underwent heart transplantation and LV myocardium became available. We had previously characterized the MyHC723 effects in M. soleus fibers from one of these patients and found reduced calcium-sensitivity in soleus fibers and a 20% increase in maximum force generation. The force increase was found to be due to increased molecular stiffness of the individual mutated myosin heads. Yet, the two FHC patients suffered from end-stage heart failure (HF), which at the cardiomyocyte level is characterized by desensitization of the β-adrenergic pathway resulting in e.g., dephosphorylation of cardiac troponin I (cTnI), myosin binding protein C (cMyBP-C), and titin. By studying cardiomyocytes from the patients with mutation R723G and comparing the data to our previous work on M. soleus fibers we had the chance to disentangle primary functional effects of the mutation from (mal)adaptive mechanisms activated in FHC myocardium. This is an essential prerequisite when searching for a common trigger of hypertrophy and possible heart failure in FHC to understand the FHC pathomechanism. We employed measurements of force and calcium sensitivity on isolated cardiomyocytes (Fig. 1A) in combination with gel-electrophoretic analyses of protein phosphorylation and isoform composition as well as structural studies by light- and electron microscopy of the two FHC MyHC723 patient’s ventricular tissue to address this question. As healthy control, cardiomyocytes isolated from LV tissue of non-transplanted donor hearts were used.

Fig. 1 Measurements of force and calcium sensitivity. (A) Cardiomyocyte experimental setup with force transducer (right) and motor for length control (left) of a cardiomyocyte, which is mounted to the tip of the needles(A, left); Cardiomyocyte from the septum of one of the MyHC723-patients mounted between motor and force transducer (A, middle); Original force record of single MyHC723-myocyte (A, right). (B) Absolute forces vs. pCa of cardiomyocytes from donor and MyHC723-patients. (C) Absolute forces vs. pCa of M. soleus fibers of healthy controls and of MyHC723-patient H27. Dotted vertical lines in (B) and (C) indicate respective pCa50 values.

 

 

In mechanically isolated, triton-permeabilized MyHC723-cardiomyocytes maximum force was 31% lower and calcium-sensitivity was unchanged compared to non-failing donor cells (Fig. 1B). In M. soleus fibers the same mutation, in contrast, caused a 23% higher maximum force and reduced calcium-sensitivity compared to controls (Fig. 1C). To identify potential causes of this discrepancy, protein phosphorylation was analyzed. Similar to previous observations in HF, we found reduced phosphorylation of troponin I and T, myosin binding protein C, and myosin light chain 2 in failing MyHC723-myocardium compared to donor. After adjustment of PKA-dependent phosphorylation of the cardiomyocytes, comparable reduced MyHC723 calcium-sensitivity in cardiomyocytes as in M. soleus fibers was found. Yet, phosphorylation of PKA sites as well as dephosphorylation of PP-1 sites did not restore maximum force of MyHC723 myocytes (data not shown). Maximum force generation of the myocytes, however, strongly depends on the myofibrillar density per cross-sectional area of the cells and the structural integrity and proper orientation of the myofibrils. Histological sections (Fig. 2A) of myocardial tissue of both MyHC723 patients demonstrated extended areas with intercellular connective tissue which was most pronounced in the septum. This was not seen in donor myocardium. Electron microscopy (Fig. 2B) revealed massive changes in ultrastructure of MyHC723 compared to donor cardiomyocytes. We observed not only Z-disc irregularities but also pronounced disarray and highly significant reduction in density of myofibrils by 26% in MyHC723 cardiomyocytes compared to donor. The structural deficits of MyHC723 cardiomyocytes most likely account for the reduced maximum force in MyHC723-cardiomyocytes and thus for the discrepancy between cardiomyocytes and M. soleus fibers of these FHC patients.

Fig. 2 Light- and electron-microscopy of myocardial tissue and myocyte ultrastructure. (A) Different from donor myocardium, LV myocardium of patients H27 and H29 shows large areas with interstitial connective tissue (dark red in Elastica van Gieson-stained sections). (B) At the subcellular level, LV myocardium from donor has well ordered myofibrils and sarcomeres, while in both patients (H27 and H29) Z-discs are irregular, myofibrillar axes are highly variable (disarray, indicated by double arrows) and myofibrillar density is reduced (magnification: 4400x).

 

 

The observations indicate that contractile function of MyHC723 cardiomyocytes of FHC patients at an advanced stage of the disease is determined by compensatory mechanisms of the myocardium like hypophosphorylation of sarcomeric proteins and secondary structural changes that mask the direct effects of the mutation seen in previous studies on M. soleus fibers from patients with the same mutation. On the other hand, secondary adaptations, e.g. increased calcium-sensitivity by changes in protein phosphorylation commonly seen in end-stage heart failure, are obscured by the primary effects of mutation R723G. These (mal)adaptations, however, fail to compensate abnormal function as they are not selective for mutated vs. wild-type myosin and thus do not equalize the primary functional differences. As we could only characterize the functional status of the MyHC723-cardiomyocytes at the time of transplantation, the primary trigger and early stages of the development of typical FHC phenotype features remain unknown. Refined longitudinal imaging studies on myocardium of genotyped family members beginning at very young age or in a suitable large animal model with cardio-vascular physiology similar to humans are needed to fully understand FHC-pathogenesis.

Weitere Projekte



Titel: Funktionelle Auswirkungen von FHC-assoziierten Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne. Biomechanische Untersuchungen an Muskelfasern aus M. soleus-Biopsien von FHC-Patienten
Leitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.)
Kooperation: Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.) Hospital Clinic, Barcelona, E; Francino, Antonio (Dr.) Hospital Clinic Barcelona, E; Perrot, Andreas, Charité, Berlin; McKenna, William, The Heart Hospital, Univ. College London, UK

Foerderung: DFG



Titel: Relative Quantifizierung des Anteils an wildtyp – und mutiertem β-kardialem Myosin auf mRNA und Protein-Ebene in myokardialem Gewebe (auf Einzelzellebene) und Soleusbiopsien von FHC-Patienten
Leitung: Montag, Judith (Dr.), Kraft, Theresia (Prof. Dr.)
Kooperation: Pich, Andreas (Prof. Dr.) Institut f. Toxikologie, MHH
Foerderung: DFG, StrucMed



Titel: Expressionsanalyse mutierter ß-Myosin-mRNA in laser-mikrodissektierten Kardiomyozyten aus Patienten mit Familiärer Hypertropher Kardiomyopathie
Leitung: Montag, Judith (Dr.)
Kooperation: Wissel, Kirsten (Dr.) HNO-Klinik, MHH
Foerderung: HiLF



Titel: Auswirkung von HCM-assoziierten Mutationen in der Kopfdomäne des ß-kardialen Myosins auf den ATP-Umsatz. Analyse am individuellen Myosinmolekül mittels TIRF-Mikroskopie
Leitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.) Scholz, Tim (Dr.)
Kooperation: Kraft, Theresia (Prof. Dr.), MHH; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.) Hospital Clinic Barcelona, E; Francino, Antonio (Dr.)Hospital Clinic Barcelona, E
Foerderung: DFG



Titel: Entwicklung eines zellulären Modells für FHC mittels Kardiomyozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen, die aus Hautfibroblasten von FHC Patienten mit Myosinmutationen generiert werden
Leitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.) Brenner, Bernhard (Prof. Dr.)
Kooperation: Martin, Ulrich (Prof. Dr.) HTTG-Chirurgie, MHH; Zweigerdt, Robert (Dr.) HTTG Chirurgie, MHH; Francino, Antonio (Dr.) Hospital Clinic Barcelona, E; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.) Hospital Clinic Barcelona, E.
Foerderung: Keine



Titel: Generierung eines FHC-Schweinemodells mit Punktmutation im ß-kardialen Myosin zur Charakterisierung der Pathogenese der FHC
Leitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.) Kraft, Theresia (Prof. Dr.)
Kooperation: Niemann, Heiner (Prof. Dr.) FLI, Institut f. Nutztiergenetik, Mariensee
Foerderung: Keine



Titel: Charakterisierung von Kontraktionseigenschaften und Ca++-Transienten isolierter Kardiomyozyten bei Hypertrophie-Entwicklung von Mäusen mit muscle RING finger (MuRF) Protein-knock-out sowie adulten Rattenkardiomyozyten unter Einfluss von Lopoteichonsäure bei gram-positiver Sepsis
Leitung: Geers-Knörr, Cornelia (Dr.) Kraft, Theresia (Prof. Dr.)
Kooperation: Niederbichler, Andreas (Dr.), Unfallchirurgie/Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, Universität Regensburg; Alekov, Alexi Kirilov (Prof. Dr.) Institut f. Neurophysiologie, MHH; Fielitz, Jens (Prof. Dr.) Charité, MDC, Berlin
Foerderung: DFG



Titel: ATP-Umsatz des individuellen Myosinmoleküls. Analyse mittels TIRF-Mikroskopie
Leitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.) Scholz, Tim (Dr.)
Kooperation: Kojima, Hiroaki (Dr.) Kansai Advanced Research Institute, Kobe, Japan
Foerderung: DFG

Titel: Änderung von Kraftbeitrag und Steifheit des Myosinmoleküls im Verlauf seines Kraftschlages. Messungen mittels Laserfalle
Leitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.)
Kooperation:Steffen, Walter (PD Dr.) Molecular- und Zellphysiologie, MHH
Foerderung: DFG



Titel: Molekulare Grundlage der Funktionsweise von Myosin 2
Leitung: Steffen, Walter (PD Dr.)
Kooperation: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.) Molekular- und Zellphysiologie, MHH; Manstein, Dietmar (Prof. Dr.) Biophysikalische Chemie, MHH; Chantler, Peter (Prof. Dr.) Royal Veterinary School, London, UK
Foerderung: DFG



Titel: 3D Rekonstruktion der Motordomäne des muskulären Myosins
Leitung: Hodgkinson, Julie L. (Dr.)
Kooperation: Morris, Edward (Dr.) The Institute of Cancer Research, London, UK
Foerderung: Keine



Titel: Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der Laserfalle
Leitung: Steffen, Walter (PD Dr.)
Kooperation:Koonce, Michael (Dr.) Wadsworth Center, Albany, USA; Kon, Takahide (Dr.) University of Tokyo, Japan
Foerderung: DFG



Titel: Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf mitotische Kinesinmoleküle
Leitung: Scholz, Tim (Dr.)
Kooperation: Kirschning, Andreas (Prof. Dr.) Institut f. Organische Chemie, LUH; Schmidt, Christoph F. (Prof. Dr.) III. Physikalisches Institut, Georg-August-Universität Göttingen
Foerderung: Keine



Titel: Einflüsse des mit der Alzheimer-Krankheit assoziierten Tau Proteins auf die Kinesinfunktion
Leitung: Scholz, Tim (Dr.)
Kooperation: Mandelkow, Eckhard (Prof. Dr.), DZNE und CAESAR Institut, Bonn
Foerderung: DFG



Titel: Klasse 1 Myosine als Regulatoren von Mikrotubulidynamik und Kinesinfunktion
Leitung: Scholz, Tim (Dr.)
Kooperation: Tsiavaliaris, Georgios (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH
Foerderung: DFG



Titel: Intrazelluläre Signalwege der Glucosewirkung bei der Weiß-Rot-Transformation des Skelettmuskels
Leitung: Meißner, Joachim (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.)
Kooperation:
Foerderung:DFG



Titel: CO2-Permeabilität biologischer Membranen: Untersuchungen der Mechanismen der Gaspermeation durch Membranproteine, die als Gaskanäle fungieren
Leitung: Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.)
Kooperation: Hedfalk, Kristina (Prof.) Dept. Chemistry Biochemistry,University of Göteborg, Schweden; Cartron, Jean-Pierre (Dr.) Centre National de la Transfusion Sanguine, INSERM, Paris, Frankreich; Rojek, Aleksandra (Dr.) Dept. Anatomy, University of Aarhus, Dänemark; Deen, Peter M.T. (Prof.) Dept. Physiology, Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Niederlande
Foerderung: DFG



Titel: CO2-Permeabilität künstlicher Lipid-Bilayer-Membranen
Leitung: Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.)
Kooperation: Itel, Fabian, Departement Chemie, Universität Basel, Schweiz
Foerderung: DFG



Titel: Mechanismus der Interaktion des Anionenaustauschers AE1 und der cytosolischen Carboanhydrase II
Leitung:Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.)
Kooperation: Supuran, Claudiu (Prof.) Dept. Chemistry, Universität Florenz, Italien; Sly, William S. (Prof.) Dept. Biochemistry and Molecular Biology, St. Louis University School of Medicine, St. Louis, USA; Alper, Seth (Prof.) Harvard University Medical School, Boston, USA; Papadopoulos, Symeon (Prof.) Institut für Vegetative Physiologie, Universität Köln
Foerderung: DFG

 



Orginalarbeiten:

  • Boron WF, Endeward V, Gros G, Musa-Aziz R, Pohl P. Intrinsic CO2 permeability of cell membranes and potential biological relevance of CO2 channels. Chemphyschem 2011;12(5):1017-1019 Hanke N, Scheibe RJ, Manukjan G, Ewers D, Umeda PK, Chang KC, Kubis HP, Gros G, Meissner JD.
  • Gene regulation mediating fibertype transformation in skeletal muscle cells is partly glucose- and ChREBP-dependent. Biochim Biophys Acta 2011;1813(3):377-389
  • Jensen MH, Watt J, Hodgkinson JL, Gallant C, Appel S, El-Mezgueldi M, Angelini TE, Morgan KG, Lehman W, Moore JR. Effects of basic calponin on the flexural mechanics and stability of F-actin. Cytoskeleton (Hoboken) 2012;69(1):49-58
  • Meissner JD, Freund R, Krone D, Umeda PK, Chang KC, Gros G, Scheibe RJ. Extracellular signal-regulated kinase 1/2-mediated phosphorylation of p300 enhances myosin heavy chain I/beta gene expression via acetylation of nuclear factor of activated T cells c1. Nucleic Acids Res 2011;39(14):5907-5925
  • Rump A, Scholz T, Thiel C, Hartmann FK, Uta P, Hinrichs MH, Taft MH, Tsiavaliaris G. Myosin-1C associates with microtubules and stabilizes the mitotic spindle during cell division. J Cell Sci 2011;124(Pt. 15):2521-2528
  • Scholz T, Vicary JA, Jeppesen GM, Ulcinas A, Hörber JK, Antognozzi M. Processive behaviour of kinesin observed using micro-fabricated cantilevers. Nanotechnology 2011;22(9):095707 Tripathi S, Schultz I, Becker E, Montag J, Borchert B, Francino A, Navarro-Lopez F, Perrot A, Özcelik C, Osterziel KJ, McKenna WJ, Brenner B, Kraft T. Unequal allelic expression of wild-type and mutated beta-myosin in familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol 2011;106(6):1041-1055





Abstracts:

2011 wurden 17 Abstracts publiziert.

Promotionen:

  • Al-Afif, Shadi (Dr. med.): Molekularbiologische Herstellung und Expression von Dihydropyridinrezeptor-Tandemkanälen zur Untersuchung der Elektromechanischen Kopplung im Skelettmuskel.
  • Seebohm, Benjamin (Dr. med.): Der Konverter als Zentrum der elastischen Verformung des Myosinkopfes: Evidenz durch Kardiomyopathie- assoziierte Myosinmutationen.
  • Steffi Lesinski , geb. Schmell (Dr. rer. nat. )
  • Maike Hinrichs (Dr. rer. nat. )



Weitere Tätigkeiten in der Forschung:

  • Brenner, Bernhard (Prof. Dr.): Gutachter für DFG, Baden-Württemberg- Stiftung, diverse Zeitschriften.
  • Kraft, Theresia (Prof. Dr.): Gutachter für DFG und diverse Zeitschriften.
  • Steffen, Walter (PD Dr.): Gutachter für diverse Zeitschriften.
  • Gros, Gerolf (Prof. Dr.): Gutachter für inländische und ausländische Forschungsförderungs-Institutionen und diverse Zeitschriften.
  • Endeward, Volker (Dr.): Gutachter für diverse Zeitschriften.
  • Meißner, Joachim (Dr.): Gutachter für diverse Zeitschriften.

Kommentare und Vorschläge an den Webmaster der Molekular- und Zellphysiologie

 

ViSdP: Prof. Dr. med. B. Brenner              Letzte Änderung 21.03.2012 (bp)