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Forschungsbericht 2010

Forschungsberichte 2008 , 2009 , 2010 , 2011 , 2012 , 2013 , 2014 , 2015 , 2016

I Forschungsprofi der Abteilung

Das wissenschaftliche Interesse des Instituts gilt den molekularen Grundlagen von Bewegungs- und Transportprozessen im menschlichen Organismus sowie Erkrankungen durch Veränderungen in den für Bewegung und Transport verantwortlichen Motorproteinen. Motorproteine können unter Verbrauch von ATP Kräfte und Bewegungen zu erzeugen und sind für praktisch alle Formen von Bewegung in der belebten Welt verantwortlich. Dazu gehören intrazelluläre Transportprozesse, Formänderungen von Zellen sowie verschiedensten Formen der Fortbewegung von Zellen und Organismen.

 

Diese vielfältigen Funktionen werden von drei große Familien von Motorproteinen erfüllt, von Myosinen, die mit Aktinfilamenten interagieren, sowie von Kinesinen und Dyneinen, die Kräfte und Bewegungen im Zusammenspiel mit Mikrotubuli erzeugen. Motorproteine sind in komplexen Strukturen wie Myofibrillen oder Flagellen organisiert, manche können aber auch als individuelle Moleküle agieren, wie beispielsweise bei intrazellulären Transportprozessen. Die Bedeutung der Motorproteine wird durch die Vielzahl von Erkrankungen deutlich, die auf Veränderungen in Motorproteinen oder in modulierenden Proteinen zurückzuführen sind. Beispiele sind die Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie (HCM oder FHC), degenerative Erkrankungen der Motoneurone, die Alzheimer-Demenz oder die Metastasierung von Tumoren.

 

Ziele unserer Forschungsprojekte sind einerseits die molekularen Funktionsprinzipien der Motorproteine, d.h. wie beispielsweise die Erzeugung von Kräften und Bewegungen über strukturelle Umlagerungen und Verformungen in den Motorproteinen an die Hydrolyse von ATP gekoppelt sind. Zum anderen wollen wir aufklären, wie Mutationen in Motorproteinen, über veränderte Funktion zu Krankheitsbildern wie der familiären hypertrophischen Kardiomyopathie führen können. Gleichzeitig geben die primären funktionellen Auswirkungen solcher Mutationen Hinweise auf die funktionelle Bedeutung der einzelnen Strukturelemente der Motorproteine. Durch Einführen gezielter Veränderungen und Expression der veränderten Motorproteine in geeigneten Expressionssystemen, z.B. E. coli, Dictyostelium discoideum oder Insektenzellen, kann die funktionelle Relevanz der einzelnen Strukturelemente systematisch aufgeklärt werden. Andererseits können die primären funktionellen Auswirkungen angeborener Mutationen genutzt werden, um Ansatzpunkte für korrigierende pharmakologische Beeinflussung der primären Funktionsstörungen zu identifizieren. Die Erforschung funktioneller Auswirkungen kleinmolekularer Modulatoren auf die verschiedenen Motorproteine sind ein weiterer Schritt zur gezielten pharmakologischen Beeinflussung gestörter motiler Funktionen. Diese Ziele erfordern ein breites experimentelles Spektrum. Entsprechend reicht das Methodenspektrum des Instituts von isolierten, nativen Kardiomyozyten und vereinfachten zellulären Systemen wie Muskelfasern oder isolierten Herzmuskelzellen, deren Membranen für direkten Zugang zu den kontraktilen Proteinen mittels Detergenzien entfernt werden, bis hin zu Einzelmolekülassays, um am individuellen Molekül Kräfte und Schrittdistanzen zu messen und über Fluoreszenzsignale mit der Bindung bzw. Abdissoziation einzelner Substrat- und Produkt-Moleküle zu korrelieren. Damit können auch nichtmuskuläre Myosine, Kinesine und Dyneine sowie in diese Proteine gezielt eingeführte Veränderungen nach Expression und Aufreinigung funktionell charakterisiert werden.

II Forschungsprojekte

The motor mechanical properties of cytoplasmic dynein In eukaryotic cells, cytoskeleton-based molecular motors perform a wide range of different functions, from cargo transport and cell signaling, to position and force sensing. These functions are executed in part through selective targeting of motors to the cargo. However, in terms of motor operation the functions are executed through four basic modes of motion: processive and non-processive movement, and travel in forward or reverse directions. For myosin and kinesin motors different operating modes are largely achieved through the use of multiple, slightly different isoforms. In contrast animal cells contain a very limited number of cytoplasmic dynein isoforms. Aside from axonemal transport a single type of motor domain performs nearly all of the cytoplasmic dynein related activities. Thus, a fundamental question in cell biology lies in understanding how the dynein motor activity is modulated to achieve multiple cellular tasks. Isoform diversity in the dynein light, light intermediate, and intermediate chains is considered crucial to specify cargo targeting and it also provides a mechanism to regulate these interactions (Ha et al., 2008). However, the activity of the dynein motor itself is likely the be governed by additional constraints. One key function of cytoplasmic dynein is to power cargo transport over long distances. Here, processivity is required, if long distance transport is carried out by a single motor. On the other hand motor processivity is not required, if long distance transport is carried out by an ensemble of motor proteins. In either case processivity and/or motor activity must be switched off, when the target area is reached. For a macromolecular machine the size and complexity of dynein, there are multiple possible mechanisms that could regulate motor activity, e.g., regulation of ATPase crossbridge cycle, load-dependency of ATPase activity, and cargo-induced motor activity. Dynein is a member of the AAA-domain proteins (ATPase associated with cellular activities). As a member of this protein family dynein has four conserved ATP binding sites. While AAA-domain-1 appears to be essential for ATP binding and -hydrolysis and force generation, the remaining tree AAA-domains appear to act as modulator of the motor function.

 

 

Optical trap approach to study motor mechanics of cytoplasmic dynein

 

The development of optical trap technology has made it possible to study the motor mechanics at the level of a single molecule. Two assays have been developed: a single bead assay which is largely used for microtubule motors and a two bead dumbbell approach (Finer et al., Nature, 368: 113-119, 1994; Steffen et al., PNAS, 98: 14949-54, 2001; Fig. 1a) which is largely used to study actin-based motors. Because of certain constrains within the two assays, the single bead assay can only be used for processive motors and the two-bead dumbbell assay has only been used for actin-based motors. In a single bead approach (Fig. 1a) the motor is attached to a bead which is held in a weak optical trap and then presented over a fi lament bound to the surface of a microscope fl ow chamber. Any effect of the motor on the trapped bead can then be detected only after the motor has overcome the compliance of the weak trap (Δx in Fig. 1b). Thus, the initial phase of the motor-filament interaction (such as the working stroke of a single motor domain) will not be detected. In the ‚dumbbell‘ arrangement (Fig. 1b) a filament is attached laterally to two derivatised latex beads, which are held in weak optical traps. The filament is stretched taut, and then presented over an immobilised motor protein. In this approach the physical properties of the filaments interconnecting the two beads becomes of critical importance. While an actin filament behaves more like a rope which easily bends at the point of contact with the beads, a microtubule behaves more like a stiff rod. Consequently, the bead-microtuble link has a high compliance and binding events of the motor protein are difficult to identify. To overcome this limitation we have developed a new approach by attaching one of the trapped beads at the minus-end of the microtubule, end-on, rather than laterally as in the conventional approach (Fig. 1c).

Fig. 1: Single bead versus dumbbell approach. (a) Single bead approach used to study processive motors. Microtubule, dynein, and bead are represented at nearly proportional size to each other emphasising the limitation of this assay; that is (1) the initial stages of the dynein microtubule interaction will not be detectable and (2) the bead will come in close contact to the surface thereby infl uencing the motion of the bead. (b) Two bead actin fi lament dumbbell approach. (c) Microtubule dumbbell approach using an end-on bead link (left bead) and a lateral bead link (right bead). GB, glass bead; LB, latex bead; OT, optical trap; S1, myosin subfragment 1.

Switching between two modes of motion: processive and non-processive

In optical trap experiments cytoplasmic dynein can select between two modes of motion, processive and nonprocessive movement (Fig.2). At 100 μM Mg-ATP cytoplasmic dynein performed repeated processive walks up to a stall force of about 3-4 pN. During the processive runs the life time of steps increased with increasing opposing force generated by the optical trap (restoring force). While individual steps are not easily resolved at low restoring force due to the limited time resolution, we could clearly resolve individual 8 nm steps at higher restoring force. The 8 nm step correlates with the distance of the tubulin dimer repeat. In contrast to what is expected for a processive motor governed by its duty ratio, processivity of cytoplasmic dynein

was impaired at lower ATP concentration. Lowering ATP concentrations resulted (a) in an decrease of the stall force and (b) in an increasing prevalence of single binding events (Fig. 2b). At 1 μM ATP cytoplasmic dynein only performed discrete single binding events which could easily be identifi ed by the reduction of the variance of the position of the trapped beads. At this low ATP concentration dynein behaved as a non-processive motor. However, processivity was again restored by adjusting the concentration of free Mg2+.

Fig. 2: Displacement record of a single cytoplasmic dynein in an optical trap. (a) processive movement of a single cytoplasmic dynein at 1 μM ATP and 0.1 mM Mg2+. (b) single binding events of cytoplasmic dynein at 1 μM ATP and 1 mM Mg2+. Projektleitung: Steffen, Walter (PD Dr.); Kooperationspartner: Koonce, Mike (Dr.), Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Kon, T (Dr.), University of Tokyo, Tokyo, Japan; Förderung: DFG

III Weitere Forschungsprojekte

  • Funktionelle und strukturelle Charakterisierung neuentdeckter Zwischenzustände der Myosinkopfdomäne (Querbrücke). Mechanische, kinetische, röntgenstrukturanalytische und elektronenmikroskopische Untersuchungen Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Kraft, Theresia (Prof. Dr.), Hodgkinson, Julie L. (Dr.); Kooperationspartner: Funari, Sergio (Dr.), HASYLAB, DESY, Hamburg; Förderung: DFG, HASYLAB (DESY)
  • Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf aktive Kräfte, Querbrückenstruktur und Querbrückenkinetik. Mechanische, röntgenstrukturanalytische und elektronenmikroskopische Untersuchungen Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Kraft, Theresia (Prof. Dr.), Hodgkinson, Julie L. (Dr.); Kooperationspartner: Manstein, Dietmar (Prof. Dr.), Institut für Biophysikalische Chemie, MHH; Funari, Sergio (Dr.), HASYLAB, DESY, Hamburg; Förderung: DFG, HASYLAB (DESY)
  • 3D Rekonstruktion der Motordomäne des muskulären Myosins mittels Elektronenmikroskopie und „single particle analysis“ Projektleitung: Hodgkinson, Julie L. (Dr.), Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Morris, Ed (Dr.), Institute of Cancer Research, London, UK
  • Charakterisierung prozessiver Myosine mittels TIRF-Mikroskopie und Laserfalle Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Manstein, Dietmar (Prof. Dr.), Tsiavaliaris, Georgios (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG (FOR629)
  • Familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (HCM): Auswirkung von HCM-assoziierten Myosinmutationen auf den ATP-Umsatz. Analyse des ATP-Umsatzes am individuellen Myosinmolekül mittels TIRF-Mikroskopie Projektleitung: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Kraft, Theresia (Prof. Dr.), Molekular- u. Zellphysiologie, MHH; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, Spanien; Förderung: StrucMed-Programm der MHH (K. Lambeck)
  • Molekulare Grundlage der Funktionsweise von Myosin 2 Projektleitung: Steffen, Walter (PD Dr.); Kooperationspartner: Brenner, Bernhard (Prof. Dr.), Molekular- u. Zellphysiologie, MHH; Manstein, Dietmar (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Chantler, Peter (Prof. Dr.), Royal Veterinary School, London, UK.; Förderung: DFG (FOR629)
  • Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der optischen Falle Projektleitung: Steffen, Walter (PD Dr.); Kooperationspartner: Koonce, Mike (Dr.), Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Kon, Takahide (Dr.), University of Tokyo, Tokyo, Japan; Förderung: DFG
  • Einflüsse des mit der Alzheimer-Krankheit assoziierten Tau Proteins auf die Kinesinfunktion Projektleitung: Scholz, Tim (Dr.); Kooperationspartner: Mandelkow, Eckhard (Prof. Dr.), MPI-ASMB, Hamburg; Manstein, Dietmar (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG ROR629
  • Klasse 1 Myosine als Regulatoren von Mikrotubulidynamik und Kinesinfunktion Projektleitung: Scholz, Tim (Dr.); Kooperationspartner: Tsiavaliaris, Georgios (Prof. Dr.), Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG FOR629
  • Mechanische Charakterisierung einzelner Kinesinmoleküle mit dem Lateral Molecular Force Mikroskop und dem Photonischen Kraftmikroskop Projektleitung: Scholz, Tim (Dr.); Kooperationspartner: Hörber, Heinrich (Prof. Dr.), Antognozzi Massimo (Dr.), University of Bristol, UK
  • Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf mitotische Kinesinmoleküle Projektleitung: Scholz, Tim (Dr.); Kooperationspartner: Kirschning, Andreas (Prof. Dr.), Institut für Organische Chemie, LUH; Schmidt, Christoph (Prof. Dr.), Georg-August-Universität Göttingen

 

Arbeitsgruppe Physiologie, Prof. T. Kraft

 

  • Charakterisierung der funktionellen Auswirkungen von HCM-assoziierten Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne. Biomechanische Untersuchungen an Muskelfasern aus M. soleus-Biopsien von HCM Patienten Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, Spanien; Öczelik, Cemil (Prof. Dr.), Charité, Berlin; McKenna, William (Prof. Dr.), The Heart Hospital, University College London, UK; Förderung: DFG
  • Funktionelle Auswirkung von HCM-assoziierten Myosinmutationen charakterisiert an einzelnen, permeabilisierten Kardiomyozyten aus dem explantierten Myokard transplantierter HCM-Patienten Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Van der Velden, Jolanda (Prof. Dr.), Freie Universität Amsterdam, Niederlande; Navarro-Lopez, Francesco (Prof. Dr.), Hospital Clinic, Barcelona, Spanien; Förderung: DFG
  • Relative Quantifizierung des Anteils an wildtyp- und mutiertem ß-kardialen Myosin auf mRNA- und Protein-Ebene in mykardialem Gewebe (Einzelzellen) und Soleusbiopsien von HCM-Patienten Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Pich, Andreas (Prof. Dr.), Toxikologie, MHH; Förderung: DFG
  • Die Auswirkungen der HCM-assoziierten W4R Mutation im Muscle Lim Protein (MLP) sowie eines MLP knock-outs auf die Funktion von Skelettmuskelfasern, untersucht an Muskelfasern aus einem W4Rknock-in und eines MLP-k.o. Mausmodell Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Knöll, Ralf (Prof. Dr.), Imperial College London, UK
  • Auswirkung der Anreicherung von Phosphat auf Kraftentwicklung und Querbrückenkinetik einzelner, permeabilisierten Kardiomyozyten der Ratte sowie des gesunden und insuffizienten menschlichen Ventrikelmyokards Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Dos Remedios, Christobal (Prof. Dr.), University of Sydney, Australien; Förderung: DFG
  • Effekte von Lipoteichonsäure aus der Zellwand von Staphylococcus aureus auf die Kontraktilität einzelner, intakter Kardiomyozyten aus adultem Rattenmyokard Projektleitung: Kraft, Theresia (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Niederbichler, Andreas (Dr.), Klinik f. Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, MHH; Alekov, Alexi (Prof. Dr.) Institut für Neurophysiologie, MHH; Förderung: StrucMed-Programm der MHH (N. Mutig); DFG

 

 

Arbeitsgruppe Veg. Physiologie

 

  • Mechanismen der metabolischen Anpassung bei der Weiß-Rot-Tranformation des Skelettmuskels. Untersuchungen der Auswirkung von Ca2+-Ionophor bzw. verschiedener Glukosekonzentrationen auf die Aktivität von Energiestoffwechselenzymen sowie die mRNA-Expression und Promoteraktivität ihrer Gene Projektleitung: Meißner, Joachim (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Scheibe, Renate (Dr.), Physiologische Chemie, MHH; Umeda, Patrick (Dr.), Birmingham, USA; Chang, Kin-Chow (Prof. Dr.), Nottingham, UK; Kubis, Hans-Peter (Prof. Dr.), Bangor, UK.; Förderung: DFG
  • Intrazelluläre Signalwege der Glucosewirkung bei der Weiß-Rot-Transformation des Skelettmuskels Projektleitung: Meißner, Joachim (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.); Förderung: DFG
  • CO2-Permeabilität biologischer Membranen: Untersuchungen der Mechanismen der Gaspermeation durch Membranproteine, die als Gaskanäle fungieren Projektleitung: Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Hedfalk, K., Göteborg, Schweden; Cartron, J.P., Paris, Frankreich; Förderung: DFG
  • CO2-Permeabilität künstlicher Lipid-Bilayer-Membranen Projektleitung: Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Itel, F., Basel, Schweiz; Förderung: DFG
  • Milchsäuretransport an der Muskelzellmembran: Transportweg über die Oberflächenmembran und über die T-tubuläre Membran Projektleitung: Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Sly, W.S., St. Louis, USA; Förderung: DFG
  • Mechanismus der Interaktion des Anionenaustauschers AE1 und der cytosolischen Carboanhydrase II Projektleitung: Endeward, Volker (Dr.), Gros, Gerolf (Prof. Dr.); Kooperationspartner: Supuran, C., Florenz, Italien; Sly, W.S., St. Louis, USA; Alper, S., Boston, USA; Papadopoulos, S., Köln; Förderung: DFG

Promotionen:

 

Dejan List, geb. Vujevic: Familiäre Hypertrophe Cardiomyopathie – Funktionelle Charakterisierung zweier Punktmutationen in der schweren Kette des Myosins von Einzelfasern des humanen M. soleus. Dr. med., MHH 27.04.2010

 

Wilhelm Walter: "Two switches turn cytoplasmic dynein into an universal motor". PhD, Ph.D.-Programm der MHH 11.06.2010

 

Aike Torben Schweda: "Mechano-chemische Koppelung von Myosin V". Dr rer. nat, LUH 18.11.2010

 

Karsten Hufendiek: Die Differenzierungsleistung von primären Skelettmuskelzellen auf verschiedenen Substraten und unter elektrischer Stimulation. Dr. rea. nat., MHH 2010

 

 

Publicationen:

 

  • Amrute-Nayak, M., Diensthuber, R.P., Steffen. W., Kathmann, D., Hartmann, F.K., Fedorov, R., Urbanke, C., Manstein, D.J., Brenner, B. & Tsiavaliaris, G. (2010) Targeted optimization of a protein nanomachine for operation in Biohybrid devices. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 312-316.
  • Radtke, K., Kieneke, D., Wolfstein, A., Michael, K., Steffen, W., Scholz, T., Karger, A., & Sodeik,B. (2010) Plus- and minus-end directed microtubule motors bind different inner tegument structures on Herpes Simplex Virus capsids. PLoS Pathogens Jul 8; 6(7):e1000991, pp20.
  • Walter, W.J., Brenner, B. & Steffen, W. (2010) Cytoplasmic dynein is not a conventional processive motor. J. Struct. Biol. 170, 266-269.
  • Borchert B, Tripathi S, Francino A, Navarro-Lopez F, Kraft T. The left and right ventricle of a patient with a R723G mutation of the beta-myosin heavy chain and severe hypertrophic cardiomyopathy show no differences in the expression of myosin mRNA. Cardiol J, 2010;17(5):518-522
  • Niederbichler AD, Papst S, Claassen L, Jokuszies A, Ipaktchi K, Reimers K, Hirsch T, Steinstraesser L, Kraft T, Vogt PM. Burn-induced organ dysfunction: vagus nerve stimulation improves cardiac function. Eplasty 2010;10:e45
  • Endeward V, Gros G, Jürgens KD. Signifi cance of myoglobin as an oxygen store and oxygen transporter in the intermittently perfused human heart: a model study. Cardiovasc Res 2010;87(1):22-29 Gros G, Wittenberg BA, Jue T.
  • Myoglobin’s old and new clothes: from molecular structure to function in living cells. J Exp Biol, 2010;213(Pt 16):2713-2725
  • Hallerdei J, Scheibe RJ, Parkkila S, Waheed A, Sly WS, Gros G, Wetzel P, Endeward V. T tubules and surface membranes provide equally effective pathways of carbonic anhydrase-facilitated lactic Acid transport in skeletal muscle. PLoS One 2010;5(12):e15137
  • Hanke N, Kubis HP, Scheibe RJ, Berthold-Losleben M, Hüsing O, Meissner JD, Gros G. Passive mechanical forces upregulate the fast myosin heavy chain IId/x via integrin and p38 MAP-Kinase activation in a primary muscle cell culture. Am J Physiol Cell Physiol, 2010;298(4):C910-C920
  • Saari S, Hilvo M, Pan P, Gros G, Hanke N, Waheed A, Sly WS, Parkkila S. The most recently discovered carbonic anhydrase, CA XV, is expressed in the thick ascending limb of Henle and in the collecting ducts of mouse kidney. PLoS One 2010;5(3):e9624

 

 

Buchbeiträge, Monografien:

 

Brenner B, Maassen N.

Physiologische Grundlagen und sportphysiologische Aspekte. In: Müller-Wohlfahrt Hans-Wilhelm, Ueblacker Peter, Hänsel Lutz. [Hrsg.]: Muskelverletzungen im Sport : 48 Tabellen. Stuttgart u.a.: Thieme, 2010. S.56-85

 

 

Abstracts: gesamt 9

 

 

Weitere Aktivitäten

 

Brenner B: Gutachter für DFG, Medical Research Council UK, diverse Zeitschriften.

 

Kraft T: Gutachterin für DFG und diverse Zeitschriften.

 

Steffen W: Gutachter für diverse Zeitschriften.

 

G. Gros ist als Gutachter für inländische und ausländische Forschungsförderungs-Institutionen tätig. G. Gros und J. Meißner sind als Referenten für verschiedene internationale Journale tätig.