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Forschungsbericht 2007

Institut für Neuroanatomie
Direktorin: Prof. Dr. rer. nat. Claudia Grothe
Institut für Neuroanatomie, OE 4140
Tel.: 0511/532-2896, Fax: 0511/532-2880
eMail: Grothe.Claudia@mh-hannover.de


I. Forschungsprofil
Im Mittelpunkt unseres wissenschaftlichen Interesses steht die physiologische Rolle neurotropher Faktoren während der neuronalen Entwicklung und bei De- und Regenerationsvorgängen im Nervensystem und deren potentielle Applikation bei neurodegenerativen Erkrankungen. Dabei interessieren uns besonders die zellulären und molekularen Interaktionen beim Morbus Parkinson und der Spinalen Muskelatrophie sowie bei der peripheren Nervenregeneration. Untersuchungen dazu werden in vitro und in vivo mit entsprechenden Mausmutanten in geeigneten Tiermodellen durchgeführt. Erkenntnisse aus diesen Studien bilden die Grundlage für die Entwicklung alternativer therapeutischer Strategien. Die Effizienz der Applikation genetisch modifizierter (Stamm)-Zellen evaluieren wir in entsprechenden Rattenmodellen des Morbus Parkinson und nach peripherer Nervenläsion im Hinblick auf die morphologische und funktionelle Integration.

II. Forschungsprojekte

Projekt: Die molekulare Pathologie der Spinalen Muskelatrophie, einer neurodegenerativen Erkrankung des Kindesalters


Die juvenile spinale Muskelatrophie ist eine neurodegenerative Erkrankung, bei der es zur Verlust spinaler Motoneurone kommt. Bei den betroffenen Patienten ist das survival of motoneuron 1 (Smn1) Gen deletiert. Das Ausmaß der Erkrankung korreliert mit der vorhandenen Menge des von einem zweiten Gen (Smn2) kodierten SMN Proteins. Kinder mit Typ I SMA (Werdnig-Hofmann) zeigen bereits vor einem Alter von 6 Monaten Symptome und sterben meist innerhalb der ersten beiden Lebensjahre. Typ II und III (Kugelberg-Welander) SMA-Patienten weisen einen milderen Verlauf auf mit Symptomen, die zwischen einem Lebensalter von 6 Monaten und 17 Jahren einsetzen. SMA ist die häufigste tödlich verlaufende autosomal-rezessive Erkrankung bei Kindern mit einer Inzidenz von 1 auf 10.000 Neugeborenen. Das SMN Protein wird in vielen Zelltypen exprimiert, jedoch kommt es im Verlauf der Erkrankung spezifisch zu einer Degeneration der Motoneurone. Die molekulare Pathologie der Spinalen Muskelatrophie ist noch weitgehend ungeklärt. Weitere Informationen über die zellulären Funktionen des SMN Proteins sind daher notwendig.

Das SMN Protein spielt eine wichtige Rolle als Assemblierungsfaktor für small nuclear ribnonucleo- protein - Komplexe (snRNPs) und ist damit indirekt am prä-mRNA Splicing beteiligt. Es wird zurzeit intensiv diskutiert, ob diese Funktion des SMN Proteins tatsächlich für die Pathogenese der Erkrankung veranwortlich ist. Bei den betroffenen Motoneuronen kommt es zu einer axonalen Degeneration und wahrscheinlich erst sekundär zu Schädigungen des Zellkörpers. Ein motorisches Neuron hat durch seine Größe besondere Leistungen zu erbringen: In der Entwicklung muss das Auswachsen der Axone zum weit entfernten Zielgebiet gesteuert werden. Darüber hinaus sind besondere Transportleistungen anterograd zum Wachstumskegel und retrograd zum Zellkörper zu erbringen. Axonale Wachstumsdefekte sind anscheinend auch bei der Pathophysiologie der Spinalen Muskelatrophie von Bedeutung. Neuere Befunde deuten darauf hin, dass SMN neben seiner Funktion als Splicing-Assemblierungsfaktor auch eine Rolle beim axonalen Transport von beta-Aktin mRNA spielen könnte. Andere Arbeiten zeigen ebenfalls einen Zusammenhang von SMN mit dem Aktin-Cytoskelett: Profilin 2 – ein Aktin bindendes Protein – wurde bereits vor einigen Jahren als Interaktionspartner beschrieben.

In unserer Arbeitsgruppe haben wir den Einfluß von SMN auf die Neuritogenese in einem Zellkultur-Modell untersucht. Dabei konnten wir einen regulatorischen Effekt von SMN auf das Aktin-Cytoskelett beschreiben (van Bergeijk J., Rydel-Könecke K., Grothe C., Claus P. (2007): Functional domain mapping of the survival of motoneuron (SMN) protein: importance of the C-terminus for neurite outgrowth. FASEB J. 21: 1492-1502). Als Modellsystem wurden Phäochromozytom-Zellen (PC12-Zellen) verwendet. Diese können unter dem Einfluß des Nervenwachstumsfaktors NGF zu neuronalen Zellen differenziert werden und repräsentieren ein Standardmodell für neuronale Differenzierung. Wir konnten zunächst zeigen, dass die SMN-Expression im Verlauf der neuronalen Differenzierung erhöht wird, während die Expression von interagierenden Proteinen unverändert bleibt (Gemin2, SmB, PRMT5) oder vermindert wird (Coilin). Dies deutet auf eine vom Splicing unabhängige Funktion von SMN im Verlauf der neuronalen Differenzierung hin. Möglicherweise besteht ein erhöhter Bedarf an SMN zur Regulation der Differenzierungsvorgänge unabhängig vom SMN-Komplex, der am prä-mRNA Splicing beteiligt ist.

Ein funktioneller knock-down von SMN durch siRNA führt zu einem signifikant reduziertem Neuritenwachstum und einer verstärkten Polarisierung der Zelle. Im Gegensatz dazu kommt es bei einer Überexpression von SMN zu signifikant verlängerten Neuriten. Undifferenzierte Neuronen besitzen zunächst eine eher sphärischeGeometrie, bevor es im Verlauf der Neuritogenese zum Aussprossen von Neuriten kommt, die dann eine dendritische oder axonale Identität annehmen. Diese morphologischen Veränderungen werden wesentlich durch die Dynamik des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Wir haben daher in knock-down und Kontrollzellen das G-/F-Aktin Verhältnis gemessen. Knock-down Zellen wiesen eine signifikante Verminderung des G-/F-Aktin Verhältnisses und damit einen höheren F-Aktin Gehalt auf. Dieser Befund ist nicht auf eine Veränderung der Aktin-Expression zurückzuführen. Welche Regionen des SMN-Proteins sind für den beobachteten Effekt der Verstärkung des Neuritenwachstums verantwortlich? Wir haben diese Frage durch eine funktionelles domain-mapping untersucht. Dabei zeigte sich, dass der C-Terminus von SMN nicht nur in der Lage ist, bei Überexpression wie das vollständige SMN Protein eine verlängerte Extension der Neuriten zu induzieren, sondern auch in einem rescue-Experiment den SMN knock-down Effekt kompensieren konnte. Interessanterweise ist der C-Terminus nicht funktionell an der Assemblierung von Splicing-Komplexen beteiligt. Wir konnten auf diesem Wege eine neue Funktion des SMN-Proteins definieren.



Abb.: Wachstumskegel eines Motoneurons; Immunfluoreszenz-Darstellung von filamentösem F-Aktin durch Färbung mit Phalloidin-Alexa 555. Wachstumskegel von SMN-defizienten Motoneuronen weisen eine signifikant kleinere Fläche auf als von Wildtyp-Tieren.

Die Regulation der Aktin-Dynamik stellt einen Schlüsselmechanismus für das Auswachsen von Neuriten dar. Die Rho/Rho-Kinase (ROCK)-Signaltransduktion nimmt dabei eine zentrale Rolle ein. Dies gilt nicht nur für die initialen Ereignisse beim Auswachsen von Neuriten, sondern auch für die Dynamik von Wachstumskegeln und die Stabilität von neuromuskulären Endplatten. Unsere Arbeitsgruppe untersucht zurzeit den Einfluß von SMN auf die ROCK-Kaskade. Damit öffnen sich möglicherweise neue Perspektiven für die Aufklärung der molekularen Pathogenese der Spinalen Muskelatrophie und für eine Therapie dieser bisher nicht heilbaren Erkrankung.
Projektleiter: PD Dr. Peter Claus; Förderung: Röchling-Stiftung, MWK-Graduiertenförderung durch das ZSN Hannover

Etablierung Polysialinsäure-basierter Gerüste als Nervenimplantate – in vitro und in vivo Evaluierung
Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe; Förderung: DFG-Forschergruppe 548

Zellbasierte Therapie im Rattenmodell des Morbus Parkinson – Morphologische und funktionelle Integration gentechnisch modifizierter neuronaler Stammzellen
Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe; Förderung: EU-Graduiertenförderung durch das Marie-Curie-Programm

Das nigrostriatale System in Mausmutanten des FGF-2 Systems während der Entwicklung und nach Läsion
Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe; Förderung: MWK-Graduiertenförderung durch das ZSN Hannover

Studie zur Regeneration peripherer Nerven nach Durchtrennung und anschließender chirurgischer End-zu-Seit-Anastomose im Modell der adulten Ratte
Projektleiter: Dr. Kirsten Haastert, Prof. Dr. Claudia Grothe, Prof. Dr. Dr. hc mult. Madjid Samii;
Förderung: Förderverein International Neuroscience Instiute Hannover

Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur Wiederherstellung peripherer Nerven nach massivem Substanzverlust durch Kombination von intraoperativer Elektrostimulation mit somatischem Gentransfer im Sinne des „Tissue Engineering“
Projektleiter: Dr. Kirsten Haastert, Prof. Dr. Claudia Grothe; Förderung: Deutsche Gesellschaft für Neurochirurgie DGNC

Zellbasierte regenerative Strategien zur Steigerung der Regenerationsleistung peripherer Nerven – Transplantation genetisch modifizierter Schwann Zellen im Nerveninterponat Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe, Dr. Kirsten Haastert; Förderung: MWK-Graduiertenförderung durch das ZSN Hannover

Zellkulturmodelle zur Untersuchung der zellulären Pathomechanismen der Spinalen Muskelatrophie und der Amyotrophen Lateralsklerose und zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Behandlung dieser Motoneuronerkrankungen
Projektleiter: Dr. Kirsten Haastert; Förderung: Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke e.V. (DGM)

Morphometrische und funktionelle Untersuchungen an Polysialinsäure-Mausmutanten nach peripherer Nervenläsion
Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe, Dr. Julia Jungnickel gemeinsam mit Prof. Dr. Rita Gerardy-Schahn, Dr. Birgit Weinhold, Abteilung Zelluläre Chemie, MHH und PD Dr. Matthias Eckhardt, Institut für Physiologische Chemie, Universität Bonn, Förderung: DFG

Physiologische Rolle des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors für die Wiederherstellung sensorischer und motorischer Funktionen nach Verletzung peripherer Nerven
Projektleiter: Dr. Julia Jungnickel, Prof. Dr. Claudia Grothe

Das survival of motoneuron (SMN) Protein und axonales Wachstum: Bedeutung für die molekulare Pathologie der Spinalen Muskelatrophie
Projektleiter: PD Dr. P. Claus; Förderung: Röchling Stiftung

The molecular pathology of the neurodegenerative disease Spinal Muscular Atrophy
Projektleiter: PD Dr. Peter Claus; Förderung: MWK-Graduiertenförderung durch das ZSN-Hannover

Charakterisierung der “Pregnancy-associated glycoproteins“ des Rindes
Projektleiter: Dr. Karl Klisch; Förderung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)



III. Publikationen


Originalpublikationen

 

Bridger PS, Haupt S, Klisch K, Leiser R, Tinneberg HR, Pfarrer C. Validation of primary epitheloid cell cultures isolated from bovine placental caruncles and cotyledons. Theriogenology. 2007 Sep 1;68(4):592-603. Epub 2007 Jun 18.

 

Grosskreutz J, Haastert K, Dewil M, Van Damme P, Callewaert G, Robberecht W, Dengler R, Van Den Bosch L. Role of mitochondria in kainate-induced fast Ca2+ transients in cultured spinal motor neurons. Cell Calcium. 2007 Jul;42(1):59-69. Epub 2007 Jan 22.

 

Grothe C, Claus P, Haastert K, Lutwak E, Ron D. Expression and regulation of Sef, a novel signalling inhibitor of receptor tyrosine kinases mediated signalling in the nervous system. Acta Histochem. 2007 Oct 31; [Epub ahead of print].

 

Haastert K, Mauritz C, Chaturvedi S, Grothe C. Human and rat adult Schwann cell cultures: fast and efficient enrichment and highly effective non-viral transfection protocol. Nature Protocols 2007; 2(1): 99-104, published online 15 February 2007.

 

Haile Y, Haastert K, Cesnulevicius K, Stummeyer K, Timmer M, Berski S, Dräger G, Gerardy-Schahn R., Grothe C. Culturing of glial and neuronal cells on polysialic acid. Biomaterials. 2007 Feb;28(6):1163-73. Epub 2006 Nov 21

 

Klisch K, Jeanrond E, Pang PC, Pich A, Schuler G, Dantzer V, Kowalewski MP, Dell A. A Tetraantennary Glycan with Bisecting N-Acetylglucosamine and the Sda Antigen is the Predominant N-Glycan on Bovine Pregnancy-Associated Glycoproteins. Glycobiology. 2007 Oct 19; [Epub ahead of print]

 

Klisch K, Mess A. Evolutionary differentiation of Cetartiodactyl placentae in the light of the viviparity-driven conflict hypothesis. Placenta. 2007 Apr;28(4):353-60. Epub 2006 May 19.

 

Koehler NK, Roebbert M, Dehghani K, Ballmaier M, Claus P, von Hoersten S, Shing M, Odin P, Strehlau J, Heidenreich F. Up-regulation of platelet-derived growth factor by peripheral-blood leukocytes during experimental allergic encephalomyelitis. J Neurosci Res. 2007 Sep 24; [Epub ahead of print]

 

Lindner M, Heine S, Haastert K, Garde N, Fokuhl J, Linsmeier F, Grothe C, Baumgärtner W, Stangel M.Sequential myelin protein expression during remyelination reveals fast and efficient repair after central nervous system demyelination. Neuropathol Appl Neurobiol. 2007 Oct 24; [Epub ahead of print].

 

Ma X, Dang X, Claus P, Hirst C, Fandrich RR, Jin Y, Grothe C, Kirshenbaum LA, Cattini PA, Kardami E. Chromation compaction and cell death by high molecular weight FGF-2 depend on ist nuclear localization, intracrine ERK activation and engagement of Mitochondria. J Cell Physiol. 2007 Dec;213(3):690-8.

 

Stark Y, Bruns S, Stahl F, Kasper C, Wesemann M, Grothe C, Scheper T. A study on polysialic acid as a biomaterial for cell culture applications. J Biomed Mater Res A. 2007 Jul 6; [Epub ahead of print].

 

Timmer M, Cesnulevicius K, Winkler C, Kolb J, Lipokatic-Takacs E, Jungnickel J, Grothe C. Fibroblast Growth Factor (FGF)-2 and FGF Receptor 3 are required for the development of the substantia nigra and FGF-2 plays a crucial role for the rescue of dopaminergic neurons after 6-Hydroxydopamine lesion. J Neurosci. 2007 Jan 17;27(3):459-71.

 

van Bergeijk J, Rydel-Könecke K, Grothe C, Claus P. The spinal muscular atrophy gene product regulates neurite outgrowth: importance of the C-terminus. FASEB J. 2007 May;21(7):1492-502. Epub 2007 Feb 22.

 

Wooding FB, Dantzer VB, Klisch K, Jones CJ, Forhead AJ. Glucose transporter 1 localisation throughout pregnancy in the carnivore placenta: light and electron microscope studies. Placenta. 2007 May-Jun;28(5-6):453-64. Epub 2006 Oct 5.




Übersichtsarbeiten

Grothe C, Timmer M. The physiological and pharmacological role of basic fibroblast growth factor in the dopaminergic nigrostriatal system. Brain Res Brain Res Rev. 54 (2007): 80-91, Epub 2007 Jan 16.  

Haastert K, Grothe C. Gene Therapy in Peripheral Nerve Reconstruction Approaches. Curr. Gene Ther. 2007,7,221-8.



Buchbeiträge

Kretschmann HJ , Weinrich W
(2007). Neuroimagem do Cranio e Neuroanatomica Clínica 3a edicao. Rio de Janeiro, RJ Editora Guanabara Koogan S.A.


Abstracts

2007 wurden 28 Abstracts publiziert.



IV. Habilitationen und Promotionen

Promotionen

Bruns, Alexander-Franzisco
(Dr. rer. nat.): Interaktion des Wachstumsfaktors FGF-2 mit dem survival of motoneuron (SMN) Protein

Haile, Yohannes (Ph.D.): In vitro and in vivo evaluation of PolySia and polySia based hydrogel in terms of survival, proliferation and differentiation of primary neurons and glial cells, immunological reaction and nerve regeneration

Jeanrond, Evelyne (Dr. med. vet.): Charakterisierung von schwangerschaftsassoziierten Glykoproteinen der frühen und peripartalen Phase der Trächtigkeit des Rindes

van Bergeijk, Jeroen(Dr. rer. nat.): Das survival of motoneuron (SMN) Protein und axonales Wachstum - Bedeutung für die molekulare Pathologie der Spinalen Muskelatrophie