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Forschungsbericht 2003


Abteilungsname: Abteilung Neuroanatomie
Direktorin: Prof. Dr. rer. nat. Claudia Grothe


I. Forschungsprofil der Abteilung

In der Abteilung Neuroanatomie stehen Fragen zur Funktion neuronaler Wachstumsfaktoren bei der Entwicklung des Nervensystems und bei neurodegenerativen Erkrankungen im Mittelpunkt des Interesses. Neben der Expression, Regulation und Funktion von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren ist der mögliche Einsatz solcher Substanzen bei der Etablierung neuer therapeutischer Strategien bei neurodegenerativen Erkrankungen Gegenstand der Untersuchungen. Besonders intensiv werden Mitglieder der Fibroblastenwachstumsfaktor-Familie (FGF-2, FGF-20) und neurotrophe Zytokine (Interleukin-6, CNTF) analysiert. Die Studien werden an neuronalen und glialen Zellkulturen, in in vivo-Läsions-Tiermodellen und an Mausmutanten des FGF-2 Systems durchgeführt. Dabei stehen mesenzephale dopaminerge Neurone und spinale Motoneurone des zentralen Nervensystems sowie periphere Nerven und Spinalganglien im Mittelpunkt des Interesses. Darüber hinaus werden die biochemischen und molekularen Interaktionen insbesondere von FGF-2 untersucht, um die Wirkungskaskaden des Faktors aufzuklären.


II. Forschungsprojekte


1. Analyse des FGF-2 Systems im peripheren Nervensystem bei Mausmutanten

Gegenstand des Projektes ist die Analyse des endogenen FGF-2 Systems nach Verletzung des N. ischiadicus in der adulten Maus unter regenerativen und degenerativen Bedingungen. Die bisher erhobenen Befunde, ein und zwei Wochen nach Nervenläsion, haben wesentlich zu einer weiteren Klärung der Funktionsweise von FGF-2 im peripheren Nervensystem beigetragen.

FGF Rezeptor (R) 3-deletierte (ko) Mäuse wurden sieben Tage nach Quetschung (regenerative Bedingungen) bzw. nach Axotomie (degenerative Bedingungen) des N. ischiadicus untersucht.

Fig. 1 FGFR3-defiziente Maus mit kyphotischen und skoliotischen Deformationen der Wirbelsäule

 


Unter degenerativen Bedingungen wurden die sensiblen Neurone im Spinalganglion L5 quantifiziert. Ein signifikanter Unterschied in der Anzahl der Spinalganglienneurone in L5 zwischen Wildtyp- und ko-Mäusen besteht bei intakten Tieren nicht. Sieben Tage nach Axotomie des N. ischiadicus und Entfernung eines 5 mm langen Nervensegments zur Verhinderung der Regeneration sterben bei Wildtyp-Mäusen ca. 22 % Neurone ab. Dieser Läsions-induzierte Neurontod findet bei den FGFR3-ko-Tieren nicht statt. FGFR3 scheint also bei diesem Szenario in Zelltod-Mechanismen involviert zu sein. Dafür spricht auch die signifikant niedrigere Anzahl pyknotischer Zellen und die geringere Zahl chromatolytischer Neurone in den verletzten L5 Ganglien von FGFR3-ko Mäusen. Die Evaluierung einzelner neuronaler Subpopulationen im L5 Spinalganglion wird augenblicklich im Hinblick auf die "calcitonin gene-related peptide" CGRP-immunreaktive Population durchgeführt; das endgültige Ergebnis steht dazu noch aus.

 

Fig. 2 Quantifizierung der L5 Spinalganglienneurone bei Fgfr3+/+ (WT) and Fgfr3+/- (KO) Mäusen 7 Tage nach Axotomie. A, Repräsentative Aufnahme eines Nissl-gefärbten L5 Spinalganglions. B, höhere Vergrößerung von A; die Pfeile zeigen auf zwei Neurone, die nach den Kriterien gezählt wurden (Nucleus, Nucleolus). C, Fgfr3+/+ Mäuse zeigen einen signifikanten Neuronverlust nach Axotomie. D, keine Änderung der Neuronanzahl war bei Fgfr3+/- Mäusen zu erkennen. ± SEM, * p < 0.05. Meßbalken: A, 100 µm; B, 20 µm.

 


Die vergleichende morphometrische Analyse des N. ischiadicus von Wildtyp- und FGFR3-ko Tieren ergab keine Unterschiede hinsichtlich der Anzahl der myelinisierten Axone. Allerdings zeigten FGFR3-defiziente Mäuse signifikant kleinere Axon- und Myelindurchmesser, wobei die Relation von Axondurchmesser zum Durchmesser der Gesamtnervenfaser bei den beiden Mausstämmen nicht unterschiedlich war. Darüber hinaus zeigten sich auch gleiche Färbungsmuster nach Immunmarkierung von Longitudinalschnitten der gequetschten Nn. ischiadici mit P0, NSE und GAP-43. Das FGFR3-mediierte Signal scheint also direkt das axonale Wachstum zu beeinflussen. Sieben Tage nach Quetschung des N. ischiadicus ergab die Quantifizierung der regenerierten myelinisierten Axone an der Läsionsstelle selbst und 0.5 und 1.0 mm distal davon keine signifikanten Unterschiede bei Wildtyp- und FGFR3-ko-Mäusen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass FGFR3 in den verletzungsbedingten Neurontod und die axonale Entwicklung im peripheren Nervensystem involviert zu sein scheint. In diesem Zusammenhang sind Berichte über eine Beteiligung von FGFR3 an apoptotischen Vorgängen in der Extremitätenentwicklung und bei Chondrozyten bemerkenswert. Der für FGF-2 bekannte neurotrophe Effekt könnte über FGFR1 oder FGFR2 mediiert werden. Neben FGF-2 wird auch FGF-7 im Spinalganglion läsionsabhängig hochreguliert, letzteres bindet aber nicht an FGFR3. Der hier für FGFR1/2 und FGFR3 vorgeschlagene bimodale Mechanismus ist tatsächlich auch für das Neurotrophin-System im Spinalganglion beschrieben. Während p75 nach einer peripheren Nervenläsion in die apoptotische Reaktion der sensiblen Neurone involviert ist, stimuliert TrkA nach Aktivierung durch NGF das Überleben der verletzten Neurone.

FGF-2-defiziente (ko) Mäuse wurden ebenfalls sieben Tage nach Quetschung (regenerative Bedingungen) bzw. nach Axotomie (degenerative Bedingungen) des N. ischiadicus untersucht.

Bei Wildtyp- und FGF-2-ko-Mäusen gibt es keine quantitativen Unterschiede hinsichtlich der Anzahl myelinisierter Axone und deren Axon- und Myelindurchmesser im intakten N. ischiadicus. Ein anderes Bild zeigte sich 7 Tage nach Quetschung des N. ischiadicus. Während an der Quetschungsstelle selbst keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl regenerierter myelinisierter Axone auftraten, waren 0.5 mm distal der Verletzung dramatische Unterschiede zu finden. FGF-2-ko Mäuse wiesen fünfmal so viel regenerierte myelinisierte Axone im Vergleich zu den Wildtypen auf. Auch Axon- und Myelindurchmesser waren bei den Mausmutanten gegenüber den Wildtypen signifikant erhöht. 1.0 mm distal der Verletzung fanden sich bei diesen Parametern keine signifikanten Unterschiede mehr.

 

 

 

 

 

Fig. 3 Repräsentative Semidünnschnitte durch die Quetschungsstelle des N. ischiadicus, sowie 0.5 mm und 1.0 mm distal davon bei Wildtypen (WT: A, C, E) und FGF-2 ko (KO: B, D, F) Mäusen. Die erhöhte Anzahl regenerierter myelinisierter Axone in FGF-2 ko Tieren 0.5 mm distal der Quetschung ist deutlich. Meßbalken: 50 µm. Quantifizierung der myelinisierten Axone verletzter Nerven bei FGF-2 Wildtypen (weiße Balken) und FGF-2 ko (schwarze Balken) Tieren. Die Gesamtzahl und die Durchmesser regenerierter myelinisierter Axone ist bei FGF-2 ko Mäusen signifikant erhöht. ± SEM (* p < 0.05, ** p < 0.01).

 

Die quantitative Analyse der Anzahl eingewanderter Makrophagen, die bei den Regenerationsvorgängen wichtige Mitspieler sind, zeigte bei beiden Mausstämmen einen zunehmenden Gradienten Richtung distal. Signifikant weniger Makrophagen waren bei den FGF-2-ko-Tieren an der Verletzungsstelle selbst zu finden im Vergleich zu den Wildtypen. Bei den kollabierten, noch nicht abgebauten Myelinprofilen war ebenfalls bei beiden Mausstämmen 1.0 mm distal noch die größte Anzahl vorhanden. Die immunzytochemische Färbung von Nervenlängsschnitten mit P0, NSE und GAP-43 ergab folgendes Bild. Während das Färbungsmuster mit NSE- und GAP-43 Antikörpern jeweils ein qualitativ gleiches Bild bei Wildtypen- und FGF-2-ko-Mäusen zeigten, waren nach der P0-Markierung morphologische Unterschiede im distalen Stumpf zu erkennen. Bei FGF-2-ko-Tiere waren mehr P0-positive "Myelinringe" zu erkennen, während bei den Wildtypen degenerierte Myelinprofile und Makrophagen typisch waren. Doppelmarkierungen von P0- mit NSE- oder GAP-43 Antikörpern zeigten deutlich, dass es sich bei den "Myelinringen" um noch nicht abgebaute Markscheiden degenerierter Axone handelte. Die morphologischen Unterschiede der P0-Markierung spiegeln also unterschiedliche Stadien der Degeneration wieder.
Neben FGF-2 sind auch andere Wachstumsfaktoren und Zytokine entscheidend am Regenerationsprozess beteiligt. Interleukin-6, zum Beispiel, wird im distalen Nervenstumpf läsionsabhängig hochreguliert. Darüber hinaus stimuliert exogen applizierter 18kD FGF-2 die Interleukin-6 und Interleukin-6 Rezeptor Expression in kultivierten Schwann Zellen. Fünf Stunden nach Verletzung des peripheren Nerven war das Ausmaß der Hochregulation der Interleukin-6 Expression im distalen Stumpf bei beiden Tierstämmen gleich, während bei Wildtyp- und ko-Mäusen im Hinblick auf die Interleukin-6-Rezeptor-Expression deutliche Unterschiede in den Kontrollnerven zu erkennen waren.
Die drastischen Unterschiede während des Regenerationsprozesses bei Wildtyp- und FGF-2-ko-Mäusen lassen sich mit den bekannten Befunden zur Expression und zu den berichteten in vitro-Effekten erklären und heben die physiologische Relevanz des Faktors bei dem Regenerationsprozess hervor. FGF-2 stimuliert die Proliferation kultivierter Schwann Zellen. Außerdem, ebenfalls nach in vitro-Befunden, ist FGF-2 ein negativer Regulator bei der Myelinisierung. Die so deutlich höhere Anzahl regenerierter myelinisierter Axone 0.5 mm distal der Verletzungsstelle bei FGF-2-ko-Tieren, kann dahingehend interpretiert werden, dass in Abwesenheit von FGF-2 eine beschleunigte Remyelinisierung stattfinden kann. Eine alternative Interpretation, dass bei den ko-Tieren ein besseres Faserwachstum stattfindet, kann ausgeschlossen werden. Zum einen ist gerade für FGF-2 in in vivo Modellen eine neuriten-induzierende Wirkung nachgewiesen worden. Zum anderen werden durch eine putativ reduzierte Proliferationsrate der Schwann Zellen in Abwesenheit von FGF-2 weniger Büngner Bänder, die als Leitschiene für das axonale Wachstums erforderlich sind, ausgebildet. Die Auswertungen der Gesamtpopulation sensibler Neurone und der CGRP-Subpopulation im Spinalganglion L5 nach Durchtrennung des N. ischiadicus sind noch nicht abgeschlossen.

FGF-2-überexprimierende (Tg) Mäuse werden augenblicklich ebenfalls untersucht. Nach den dramatischen Unterschieden nach Quetschung des Nerven bei FGF-2-ko- und Wildtyp-Mäusen, sind auch bei den TgFGF-2-Tieren interessante Ergebnisse zu erwarten. Verantwortlicher Projektleiter: Dr. Julia Jungnickel, Prof. Dr. Claudia Grothe Drittmittelgeber: DFG


2. Untersuchungen zur Interaktion des survival of motoneuron Proteins SMN mit dem neurotrophen Fibroblastenwachstumsfaktor -2 (FGF-2): Bedeutung für die molekulare Pathologie der Spinalen Muskelatrophie
Verantwortlicher Projektleiter: Dr. Peter Claus
Drittmittelgeber: Fritz Thyssen Stiftung

3. Interaktion des survival of motoneuron Proteins SMN mit dem neurotrophen Fibroblastenwachstumsfaktor -2 (FGF-2)
Verantwortlicher Projektleiter: Dr. Peter Claus
Drittmittelgeber: Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke e.V. (DGM)

4. Analyse von Mutanten des survival of motoneuron Proteins SMN in Motoneuronen
Verantwortliche Projektleiter: Dr. Kirsten Haastert, Dr. Peter Claus

5. Transfektion hoch angereicherter DA-Progenitorzellen zur Überexpression von FGF-2 und FGF-20; Charakterisierung der Kulturen
Verantwortlicher Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe
PhD-Stipendium für Konstantin Cesnulevicius, Zentrum für systemische Neurowissenschaften

6. Morphologische, elektrophysiologische und Verhaltensstudie im M. Parkinson-Model der Ratte nach Transplantation genetisch modifizierter DA-Progenitorzellen
Verantwortlicher Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe, Prof. Dr. Johannes Bufler (Neurologie, MHH)
PhD-Stipendium für Konstantin Cesnulevicius, Zentrum für systemische Neurowissenschaften

7. Analyse des nigrostriatalen Systems in Mausmutanten (FGF-2 ko; TgFGF-2), in intakten Tieren und nach Neurotoxin-Läsion (6-OHDA) der DA-Neurone
Verantwortlicher Projektleiter: Prof. Dr. Claudia Grothe

8. Funktionelle in vivo Untersuchung zur Rolle des FGF-2 Systems bei der Regeneration peripherer Nerven - Einsatz genetisch veränderter Schwann Zellen im in vivo-Regenerationsmodell des Nervus ischiadicus der adulten Ratte
Verantwortlicher Projektleiter: Dr. Kirsten Haastert, Prof. Dr. Claudia Grothe
Drittmittelgeber: DFG

9. Etablierung hoch angereicherter adulter Schwann Zellen, genetische Modifikation und Charakterisierung
Verantwortlicher Projektleiter: Dr. Kirsten Haastert
Drittmittelgeber: Kogge-Stiftung für veterinär-medizinische Forschung

III. Publikationen

1. Originalpublikationen

Claus P, Döring F, Gringel S, Müller-Ostermeyer F, Fuhlrott J, Kraft T, Grothe C. Differential intranuclear localization of fibroblast growth factor-2 isoforms and specific interaction with the survival of motoneuron protein. J Biol Chem. 2003; 278:479-85.


Timmer,M., Robben,S., Müller-Ostermeyer,F., Nikkhah,G., Grothe,C. : Axonal regeneration across long gaps in silicone chambers filled with Schwann cells over-expressing high molecular weight FGF-2. Cell Transplant. 12, 265-77, 2003.


Jungnickel,J., Gransalke,K., Timmer,M., Grothe,C. : Fibroblast growth factor receptor 3 signaling regulates injury-related effects in the peripheral nervous system. Mol. Cell. Neurosci., 2003; published online 10.1016/j.mcn.2003.09.014.


Jungnickel,J., Claus,P., Gransalke,K., Timmer,M., Grothe,C. : Targeted disruption of the FGF-2 gene affects the response to peripheral nerve injury. Mol. Cell. Neurosci., in press.


Claus,P., Werner,S., Timmer,M., Grothe,C. : Expression of the fibroblast growth factor-2 isoforms and the FGF receptor 1 - 4 transcripts in the rat model system of Parkinson`s disease. Neurosci. Lett., in press.


Timmer,M. , Kloth,V., Scholz,T., Winkler,C., Grothe,C.CA*, Nikkhah,G.*: Enhanced functional recovery and reinnervation of intrastriatal dopamine-grafts co-transplanted with physiological Schwann cells over-expressing high molecular weight FGF-2 isoforms. Exp. Neurol., in press. CA Corresponding Author; * contributed equally


Nindl,W., Kavakebi,P., Claus,P., Grothe,C. , Pfaller,K., Klimaschewski,L. Expression of basic fibroblast growth factor isoforms in postmitotic sympathetic neurons: synthesis, intracellular localization and involvement in karyokinesis. Neuroscience, in press.


Petri S, Krampfl K, Hashemi F, Grothe C, Hori A, Dengler R, Bufler J. Distribution of GABAA receptor mRNA in the motor cortex of ALS patients. J. Neuropathol. Exp. Neurol.. 62(10):1041-51, 2003.

2. Buchbeiträge, Bücher

Berens v. Rautenfeld D, Claus P. Terminal Vascular System (Microcirculation), Interstitial Connective Tissue, Connective Tissue, Lymph Capillaries and Precollectors. In: Földi M, Földi E, Kubik S, editors. Textbook of Lymphology. München,
Jena: Urban & Fischer; 2003. p. 168-177.

Kretschmann HJ, Weinrich W. Cranial Neuroimaging and Clinical Neuroanatomy. Atlas of MR Imaging and Computed Tomography. 3rd edition.
Stuttgart, New York: Thieme; 2003.


3. Abstracts

2003 wurden 12 Abstracts publiziert.

IV. Habilitationen, Promotionen und Diplomarbeiten
Dipl. biol. Kathleen Gransalke: Rolle des FGF-Systems bei der Regeneration im peripheren Nervensystem.