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Forschungsbericht 2002



Abteilung Neuroanatomie

Direktorin: Prof. Dr. rer. nat. Claudia Grothe


Periphere Nervenregeneration nach Transplantation genetisch veränderter Schwann Zellen

 


Im Mittelpunkt der Studie steht die Frage, ob durch Transplantation genetisch veränderter Schwann Zellen ein verbessertes Wiederauswachsen peripherer Nerven nach großem Substanzverlust stimuliert werden kann.
Periphere Nerven besitzen im Gegensatz zu zentralen Nervenfasern die Fähigkeit zur Regeneration. Allerdings hängt der Erfolg der Regeneration entscheidend von der Größe der Nervenunterbrechung ab. Klinisch relevant sind Verletzungen des Plexus brachialis als Folge von Ausrissen der ventralen und/oder dorsalen Wurzel zum Beispiel nach Motorradunfällen oder während des Geburtsvorgangs.
Konventionelle neurochirurgische Strategien umfassen die direkte Verbindung des proximalen und distalen Nervenstumpfes, was bei großem Substanzverlust kaum möglich ist, sowie die Implantation autologer Nerventransplantate, deren Verfügbarkeit allerdings limitiert und mit Verletzung der Spendernerven verbunden ist. Schließlich werden die proximalen und distalen Stümpfe durch Röhrchen verbunden, allerdings mit mäßigem Regenerationserfolg. Die Röhrchen können aber als Container für Substanzen oder Zellen dienen, die die regenerative Kapazität peripherer Nerven steigern. In unserem experimentellen Ansatz wird nun erstmals der Einsatz neurotropher Faktoren (NTF) und Schwann Zellen verbunden und solche Zelle implantiert, die einen NTF überexprimieren.
In umfangreichen qualitativen und quantitativen biochemischen, molekularbiologischen und morphologischen Untersuchungen konnten wir zeigen, dass der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) und bestimmte hoch-affine FGF Rezeptoren (R) nach Verletzungen peripherer Nerven hochreguliert werden. Mittels Ko-Lokalisations-Studien konnten wir zeigen, dass FGF-2 und seine Rezeptoren in Schwann Zellen und Makrophagen exprimiert werden.
Darüber hinaus konnten wir durch exogene Administration von FGF-2 den läsionsinduzierten Neurontod verhindern. Zwei anderen Gruppen gelang nach Applikation von gelöstem oder gebundenem FGF-2, das Auswachsen von Axonen zu stimulieren.
Auf dieser Grundlage wurde ein Rattenmodell etabliert bei dem FGF-2 transfizierte Schwann Zellen nach Nervenverletzung implantiert und deren Effekte auf eine mögliche verbesserte Nervenregeneration evaluiert wurden (Abb. 1). Die Schwann Zellen wurden aus dem N. ischiadicus neugeborener Ratten gewonnen und in zwei Schritten hoch angereichert. Die zu fast 100% sauberen Kulturen wurden anschließend mit FGF-2 transfiziert. Der Erfolg der Transfektion wurde im Western Blot überprüft. Die Zellen wurden in einem Gemisch mit Matrigel in Röhrchen gefüllt und diese dann als Interponat zwischen proximalem und distalem Nervenstumpf des N. ischiadicus adulter Ratten implantiert. Die dabei zu überbrückende Strecke beträgt in unserem Modell 15mm, eine Länge, bei der physiologisch kaum oder keine Regeneration stattfindet. Vier Wochen nach der OP wurden die in den Röhrchen gewachsenen Gewebekabel eingebettet und der weiteren morphologischen Untersuchung unterzogen.

 

 

 

Die Semidünnschnitte der Gewebekabel der verschiedenen experimentellen Gruppen zeigen eine unterschiedliche Ausstattung mit myelinisierten Axonen (Abb. 2). Sowohl die myelinisierten regenerierten Axone als auch die neu entstandenen Blutgefäße wurden halbautomatisch mit einem Computerprogramm auf AnalySIS-Basis morphometrisch evaluiert

                          

Die verschiedenen experimentellen Gruppen erhielten als Interponate Silikonröhrchen, die entweder nur Matrigel enthielten (A) oder mit nicht-transfizierten Schwann Zellen (B), mit Schwann Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert wurden (C) oder mit Schwann Zellen, die die höher molekularen FGF-2 Isoformen überexprimierten (D) gefüllt wurden. In allen Gruppen wurden nach vier Wochen in den Röhrchen Gewebekabel oder Stümpfe gefunden. Im Hinblick auf die Anzahl regenerierter myelinisierter Axone zeigte die Tiergruppe, die FGF-2 über-exprimierende Schwann Zellen erhalten hatte, die signifikant größte Anzahl regenerierter Nervenfasern.
Auf der Grundlage dieser Pilotstudie werden augenblicklich folgende Fragestellungen verfolgt. Bei gleichem experimentellen Design werden die Regenerate nach längeren postoperativen Zeiten im Hinblick auf verschiedene Parameter analysiert. Dabei handelt es sich zum einen wieder um die morphometrische Quantifizierung der regenerierten myelinisierten Axone und Blutgefäße. Zum anderen interessiert uns die Qualität der regenerierten Nervenfasern. Zur Untersuchung der Frage werden Fluoreszenzfarbstoffe in den distalen Nervenstumpf appliziert, retrograd transportiert und die dadurch markierten Motoneurone in den entsprechenden Rückenmarkssegmenten und die markierten sensiblen Neurone in den Spinalganglien L4 bis L6 quantifiziert. Weiterhin wird das Ausmaß der funktionellen Reinnervation z. B. mittels Gangbildanalysen gemessen. Schließlich kommt für eine mögliche spätere klinische Anwendung des somatischen Gentransfers zur Steigerung der Regenerationsleistung peripherer Nerven unter anderem den zu transplantierenden genetisch veränderten Zellen eine zentrale Bedeutung zu. Wünschenswert wären autologe Transplantate. Dazu werden augenblicklich möglichst hoch angereicherte Kulturen adulter Schwann Zellen der Ratte und des Menschen etabliert und die Kulturen nach Transfektion hinsichtlich ihrer zellulären Zusammensetzung, ihrer Proliferationsrate und weiterer Parameter analysiert. Diese Studien können einen Beitrag bei der Entwicklung neuer Strategien zur Verbesserung der Nervenregeneration nach großem Substanzverlust liefern.

Mitarbeiter: K. Haastert, C. Grothe

Förderung: DFG

 

Weitere Forschungsprojekte

Analyse des N. ischiadicus bei genetisch veränderten Mäusen

Um die Rolle des endogenen FGF-2 Systems im peripheren Nerven zu evaluieren, wurde der N. ischiadicus bei verschiedenen Mausmutanten (FGF Rezeptor 3 ko; FGF-2 ko; tgFGF-2) im Hinblick auf Anzahl und Durchmesser der myelinisierten Axone und Blutgefäße morphometrisch analysiert. Während intakte FGFR3 ko Tiere signifikant kleinere Fasern aufwiesen, zeigten FGF-2 ko Tiere keine Unterschiede verglichen mit den entsprechenden Wildtyp-Mäusen. Dafür war bei den FGF-2 ko Tieren nach peripherer Nervenquetschung die Anzahl regenerierter Axone an der Läsionsionstelle signifikant erhöht im Vergleich zu Kontrolltieren. Diese Befunde unterstreichen die physiologische Bedeutung des FGF-2 Systems für die Entwicklung, Erhaltung und Regeneration des peripheren Nervensystems.

Mitarbeiter: J. Jungnickel, C. Grothe

Förderung: DFG

 

Interaktion des kernständigen Fibroblastenwachstumsfaktors FGF-2 mit dem Survival of Motoneuron Protein (SMN) und dem Splicing Faktor SF3a66

Die spinale Muskelatrophie ist eine Erkrankung bei der Motoneurone im Vorderhorn des Rückenmarks degenerieren. Die Erkrankung ist mit Mutationen des smn1-Gens assoziiert. Das SMN-Protein ist ein notwendiger Assemblierungsfaktor für spliceosomale Komplexe. In unserer Arbeitsgruppe konnte erstmals die direkte Interaktion mit einem Wachstumsfaktor, FGF-2, nachgewiesen werden. In vitro und in vivo Modelle werden zur funktionellen Analyse dieser Protein-Protein Interaktion herangezogen. Ein wichtige Methode stellt dabei die Analyse der intrazellulären Dynamik fluoreszenzmarkierter Proteine in lebenden Zellen dar.

Mitarbeiter: P. Claus, C. Grothe

Förderung: Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke (DGM)

 

Die Heterogenität olfaktorischer Hüllzellen (´olfactory ensheathing cells´)

Durch Antikörper-gestützte Techniken werden Subpopulationen olfaktorischer Hüllzellen in reiner Form dargestellt und einer funktionell-molekularen Analyse unterzogen. In vitro- und in vivo-Experimente werden mit dem Ziel durchgeführt, zu untersuchen, ob die bislang beobachteten regenerationsfördernden Eigenschaften (z.B. axonale Regeneration, Remyelinisieriung) ein generelles Kennzeichen olfaktorischer Hüllzellen sind, oder, ob eine funktionelle Spezialisierung der Subpopulationen vorliegt.

Mitarbeiter: K. Wewetzer

Förderung: HiLF II-Programm (MHH)

 

Vergleichende Analyse der in vivo-Effekte olfaktorischer Hüllzellen und Schwann-Zellen nach Transplantation in das lädierte Nervensystem

Kulturen olfaktorischer Hüllzellen und Schwann-Zellen werden in vergleichbar hoher Reinheit gewonnen und in das lädierte Nervensystem (Nervus facialis, Nervus ischiadicus) transplantiert. Parallel dazu werden die Kulturen im Hinblick auf die Expression regenerationsrelevanter Zytokine mittels real time PCR vergleichend analysiert. Ziel des Projektes ist die Beantwortung folgender Fragen: Induzieren olfaktorische Hüllzellen und Schwann-Zellen tatsächlich differentielle Effekte? Existieren quantitative und/oder qualitative Unterschiede im Hinblick auf die Expression regenerationsrelevanter Zytokine?

Mitarbeiter: K. Wewetzer, D. Angelov (Institut für Anatomie I, Universität Köln), E. Lang (Plastische Handchirurgie, Universität Freiburg), M. Kirsch (Anatomisches Institut I, Universität Freiburg)

 

Die Beeinflussung von axonaler Regeneration und Kollateralbildung adulter Facialismotoneurone durch Transplantation mesenchymaler Knochenmarks-stammzellen

Knochenmmarksstammzellen der adulten Ratte werden in hochreiner Form gewonnen und mittels Silikonröhrchen als Nerveninterponat in den lädierten Nervus facialis adulter Ratten transplantiert. Nach zwei Monaten wird das Überleben und die Differenzierung der transplantierten Stammzellen untersucht und die Beeinflussung der Regeneration anhand morphologischer und funktioneller Kriterien analysiert.

Mitarbeiter: K. Wewetzer, O. Guntinas-Lichius (HNO-Klinik, Universität Köln)

Förderung: Köln Fortune Programm (O. Guntinas-Lichius)

 

Reinigung, Charakterisierung und Transplantation olfaktorischer Hüllzellen des transgenen Schweins in das experimentell demyelinisierte Rückenmark

Im Hinblick auf eine gesteigerte Verträglichkeit bzw. verminderte Abstossung hergestellte transgene Schweine (CD59, H-Transferase) werden zur Isolierung olfaktorischer Hüllzellen genutzt. Nach sorgfältiger Charakterisierung der Zellen in vitro wird eine Implantation der Zellen in das experimentell demyelinisierte Rückenmark mit dem Ziel vorgenommen, das regenerative Potential der Zellen näher zu analysieren.

Mitarbeiter: Mitarbeiter: K. Wewetzer, JD Kocsis (Yale University, USA), WL Fodor (Alexion Pharmaceuticals Ins, USA)

Förderung: Stolte Programm (C. Radtke)

 

Originalpublikationen


Claus P., Döring F, Gringel S, Müller-Ostermeyer F, Fuhlrott J., Kraft T., Grothe C. Differential Intranuclear Localization of Fibroblast Growth Factor - 2 (FGF-2) Isoforms and Specific Interaction with the Survival of Motoneuron Protein. J. Biol. Chem. 2002 (Published online
Oct. 22, 2002; 10.1074/jbc.M206056200).


Guntinas-Lichius O, Wewetzer K, Tomov TL, Azzolin N, Kazemi SH, Streppel M, Neiss WF, Angelov DN. Transplantation of olfactory mucosa minimizes the axonal branching and promotes the recovery of vibrissae motor performance after facial nerve repair in rats J. Neurosci. 2002, 15: 7121-31.


Jedrusik M.A., Vogt S., Claus P., Schulze E.: A novel type of linker histone is a cytoplasmic filament associated protein in Caenorhabditis elegans.
J. Cell Sci. 2002, 115: 2881-2891.

Plischke,M., Wolf,k.-H., Krofczik,S., Rinkwitz,S., Grothe,C., Pretschner,D.P., Seidl,K.: 4D-Atlas der embryonalen Mausentwicklung. Proc. of Workshop Bildverarbeitung in der Medizin, 2002, 295-298.


Stieglitz, T., Poessnecker, J., Rosahl, S.K., Haastert, K., Brinker, T., Meyer, J.-U., "Erste chronische Ergebnisse von flexiblen Siebelektroden als Schnittstelle zu Nervenstümpfen", 36. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Biomedizinische Technik, Biomedizinische Technik, Bd. 2002, 47, Erg.band 1.


Streppel,M., Azzolin,N., Dohm,S., Guntinas-Lichius,O., Tomov,T.L., Haas,C., Grothe,C., Wevers,A., Neiss,W.F., Angelov,D.N.: Focal application of neutralizing antibodies to soluble neurotrophic factors improves the quality of axonal pathfinding after peripheral nerve lesion. Eur. J. Neurosci. 2002, 15: 1327-1342.


Timmer,M., Robben,S., Müller-Ostermeyer,F., Nikkhah,G., Grothe,C.: Axonal regeneration across long gaps in silicone chambers filled with Schwann cells over-expressing high molecular weight FGF-2. Cell Transplant., in press.

 

Übersichtsartikel


Wewetzer K, Verdú E, Angelov DN, Navarro X. Olfactory ensheathing glia and Schwann cells: two of a kind? Cell Tissue Res 2002, 309: 337-45.


Abstracts

2002 wurden 15 Abstracts publiziert.