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Forschungsbericht 2001

 



Abteilung Neuroanatomie

Direktorin: Prof. Dr. rer. nat. Claudia Grothe


Interaktionen des kernständigen Fibroblastenwachstumsfaktors-2 (FGF-2) mit dem Survival of Motoneuron Protein (SMN) und dem Splicing-Faktor SF3a-66

 


Der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) gehört zu der mittlerweile 23 Mitglieder zählenden FGF-Familie. FGFs sind während der Entwicklung und im adulten Organismus an einer Vielzahl biologischer Prozesse, wie z.B. Mitogenese, Angiogenese, Chemotaxis, Mesoderminduktion und der Differenzierung von Zellen mesodermaler und neuroektodermaler Herkunft beteiligt. Das FGF-Signal wird über niedrig-affine Rezeptoren, den Heparansulfat-Proteoglykanen und über hoch-affine transmembranäre Tyrosinkinase-Rezeptoren (FGFR) mediiert.
FGF-2 kommt in mehreren Isoformen vor, deren Bildung von einer gemeinsamen mRNA an alternativen Start-Codons translational reguliert wird. So wird der 18kD FGF-2 am AUG Start-Codon translatiert, während die Herstellung der höhermolekularen Isoformen (21kD, 23kD) an CUG Start-Codons initiiert wird. Die FGF-2 Isoformen zeigen eine unterschiedliche intrazelluläre Verteilung. Wie die Western Blot-Analyse subzellulärer Fraktionen zeigte, ist der 18kD FGF-2 im Zytoplasma und Kern lokalisiert, während die höhermolekularen Formen vor allem im Nukleus vorkommen. Auch über andere mitogene Wachstumsfaktoren, wachstumsregulierende Proteine und Wachstumsfaktorrezeptoren gibt es Berichte zur Lokalisation im Kern und dessen Substrukturen, was für ein allgemeineres Phänomen einiger Wachstumsfaktoren spricht. Es ist daher denkbar, daß die nuklearen Funktionen unabhängig von den extrazellulären Faktoren wirksam sind.
Die intranukleare Lokalisation und Funktion der FGF-2-Isoformen wurde in unserer Arbeitsgruppe intensiv analysiert. Bisherige Studien zur subzellulären Lokalisation der FGF-2 Isoformen wurden zum einen mittels der Western Blot-Analyse durchgeführt. Zum anderen wurde in vielen morphologischen Untersuchungen die Kernlokalisation immunzytochemisch gezeigt, allerdings ohne die Möglichkeit zur Diskriminierung zwischen 18kD und höhermolekularen Isoformen. In den eigenen Studien wurde daher ein Ansatz gewählt, der es erlaubt, das Lokalisationsmuster einzelner Isoformen im Kern zu untersuchen und darüber hinaus Deletions- und Mutationsexperimente an den Isoformen vorzunehmen. Dazu wurden die Isoformen mit EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) bzw. DsRed (Discosoma Red Fluorescent Protein) fusioniert und anschließend immortalisierte Schwann-Zellen mit den Konstrukten transfiziert. Diese Vorgehensweise erlaubt die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung einzelner Isoformen an lebenden Zellen und zeigte eine distinkte Verteilung der 18kD und der 23kD FGF-2-Isoformen.
Der 18kD FGF-2 zeigte eine schwache Lokalisation im Zytoplasma und eine starke Anreicherung im Kern (Abb.1a). Im Kern war das Fluoreszenzsignal mit den Nukleoli, dem Nukleoplasma und bestimmten Kernkörpern assoziiert, bei denen es sich um Cajal bodies (früher coiled bodies) handelt. Der 23kD FGF-2 war in Nukleoli und im Nukleoplasma in einem Punktmuster verteilt. In sich teilenden Zellen ist das Protein mit den Chromosomen assoziiert. Neben der Kernlokalisationssequenz (NLS) im N-Terminus des 23kD FGF-2 gibt es offenbar eine zweite Sequenz, die für die nukleare Lokalisation verantwortlich ist. Mittels ´site-directed´ Mutagenese konnte eine weitere NLS im Bereich der 18kD-Isoform identifiziert werden.

Abb. 1. (a) Differentielle Verteilungen der FGF-2 Isoformen in Zellkernen von Schwann Zellen. Die Isoformen wurden mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert und die Zellen mit den Konstrukten transfiziert. Die Verteilung kann mit dieser Methode an lebenden Zellen untersucht werden. (b) Interaktion von FGF-2 mit survival of motoneuron Protein (SMN). In Immun-Präzipitationsexperimenten bindet SMN an die 23 kD FGF-2 Isoform, nicht aber an die 18 kD Isoform.

 

Mit welchen Proteinen interagiert die FGF-2 im Zellkern ? Unsere Arbeitsgruppe konnte zwei Proteine identifizieren: Dabei handelt es sich um das ´survival of motorneuron´ Protein (SMN) und einen Splicing Faktor.
Die spinale Muskelatrophie (SMA; Typ I, II, III), eine autosomal-rezessive Erkrankung, bei der spinale Motoneurone und motorische Hirnnervenkerne degenerieren, ist mit der Deletion und mit Mutationen des SMN1-Gens assoziiert. Das SMN-Protein selbst ist u.a. ein notwendiger Assemblierungsfaktor für spliceosomale Komplexe und weist eine interessante subzelluläre Verteilung auf: Neben der Lokalisation im Cytoplasma findet sich SMN im Zellkern in Gemini der Cajal-bodies, den Cajal-bodies selbst und auch in Nukleoli. Bei Patienten mit SMA ist der Transport von SMN in den Zellkern gestört. Es ist bisher unklar, warum es dabei zur selektiven Degeneration von Motoneuronen, nicht aber von anderen Zelltypen kommt. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, daß SMN spezifisch mit der 23 kDa FGF-2-Isoform interagiert, nicht aber mit der 18 kDa Isoform (Abb.1b). Da FGF-2 ein neurotropher Faktor ist, der auch bei der Entwicklung von Motoneuronen eine Rolle spielt, ergeben sich interessante Ansatzpunkte für weitere Analysen.
Im Two-Hybrid-Screen konnte ein Splicing-Faktor, SF3a-66, als ein mit dem 23kD FGF-2 interagierendes Protein identifiziert werden. Weiterführende Experimente haben gezeigt, daß SF3a-66 auch in vitro mit FGF-2 interagieren kann: ´GST-pull-down´-Experimente bestätigen die im ´Two-Hybrid-Screen´ identifizierte Interaktion. SF3a ist ein spliceosomales Protein, daß mit einer anderen Untereinheit (SF3a-120) interagiert und an die 15S U2 snRNP Komplexe bindet. Der aktive U2 snRNP Komplex wird im Cytoplasma assembliert, wobei eine weitere Untereinheit (SF3a-60), die aber nicht an SF3a-66 bindet, einbezogen wird. Die Daten ergeben einen interessanten funktionellen Zusammenhang zwischen FGF-2 und SMN bzw. SF3a-66 und könnten darauf hindeuten, daß intrazelluläres FGF-2 eine wichtige Rolle beim RNA-Metabolismus spielt.

Mitarbeiter: P. Claus, C. Grothe

Förderung: HiLF-Programm

 

Weitere Forschungsprojekte


Die Rolle des endogenen FGF-2 Systems bei der Regeneration peripherer Nerven

An genetisch veränderten Mausstämmen (FGF-2 ko; Tg FGF-2; FGFR3 ko) werden die Spinalganglien (L4 - L6) und der N. ischiadicus im intakten Tier und nach peripherer Nervenläsion untersucht. Die Anzahl der sensorischen Neurone und deren Transmitterexpression sowie die Anzahl der myelinisierten Nervenfasern werden morphometrisch mittels einer PC-gestützten Bildverarbeitung evaluiert.

Mitarbeiter: J. Jungnickel, C. Grothe, G. Nikkhah (Abteilung für Funktionelle und Stereotaktische Neurochirurgie, Universität Freiburg)

Förderung: DFG

 

Stimulation der peripheren Nervenregeneration nach exogener FGF-2 Applikation

Am Regenerationsmodell des N. ischiadicus der adulten Ratte werden die Effekte der FGF-2 Isoformen auf die regenerative Kapazität hin analysiert. Die Applikation des FGF-2 erfolgt mittels Transplantation genetisch veränderter physiologischer Schwann Zellen. Die Regenerationsleistung wird morphologisch, morphometrisch und funktionell evaluiert.

Mitarbeiter: C. Grothe, G. Nikkhah (Abteilung für Funktionelle und Stereotaktische Neurochirurgie, Universität Freiburg)

Förderung: DFG

 

Untersuchung der physiologischen Rolle des endogenen basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF-2) im nigrostriatalen System der Maus

Mittels transgener Mauslinien, in denen die Gene für FGF-2 und einen seiner Rezeptoren, FGFR3, gezielt inaktiviert wurden sowie einer weiteren Linie, die FGF-2 überexprimiert, soll im Rahmen dieses Projekts die physiologische Rolle des endogenen FGF-2 Systems geklärt werden: 1. Die Rolle von FGF-2 bei der Entwicklung der dopaminergen (DA) Neurone in der Substantia nigra bzw. dessen physiologische Funktion bei der Erhaltung der DA Neurone. 2. Die physiologische Relevanz von FGF-2 im nigrostriatalen System unter degenerativen Bedingungen. 3. Der Einfluß einer endogenen FGF-2-Umgebung auf die Integration von transplantierten DA Zellen im Striatum und deren anatomische und funktionelle Restauration im nigrostriatalen System.

Mitarbeiter: S. Rinkwitz, C. Grothe, G. Nikkhah (Abteilung für Funktionelle und Stereotaktische Neurochirurgie, Universität Freiburg)

 

Die Rolle von FGF-2 und FGF-20 im dopaminergen nigrostriatalen System

Die Effekte von Wachstumsfaktoren (FGF-2, FGF-20) auf das Überleben und die Differenzierung von dopaminergen Neuronen oder dopaminergen Präkursoren wird in Dissoziationskulturen analysiert. Im Ratten-Modell des Morbus Parkinson wird die Expression und Regulation des FGF-Systems qualitativ und quantitativ untersucht. Darüber hinaus werden in diesem Modell mögliche therapeutische Effekte von FGF-2 und FGF-20 studiert. Dazu werden die im Labor rekombinant hergestellten Faktoren direkt appliziert oder durch somatischen Gentransfer mittels genetisch veränderter physiologischer Schwann Zellen in das Hirngewebe eingebracht.

Mitarbeiter: C. Grothe, G. Nikkhah (Abteilung für Funktionelle und Stereotaktische Neurochirurgie, Universität Freiburg)

 

Charakterisierung olfaktorischer Gliazellen (olfactory ensheathing cells, OECs) in vitro und in vivo

Die Charakterisierung von OECs der neonatalen und adulten Ratte wird mit dem Ziel vorgenommen, ihre Verwendbarkeit innerhalb therapeutischer Strategien für Nervensystem-Verletzungen und -Erkrankungen näher zu definieren und ihre physiologische Funktion besser zu verstehen. OECs werden in vitro elektrophysiologisch (´Patch-Clamp`) und molekular (RT-PCR) analysiert und in das experimentell verletzte Nervensystem (Nervus facialis) implantiert.

Mitarbeiter: K. Wewetzer, J. Buffler (Neurologie, MHH), D. Angelov (Institut I für Anatomie, Universität Köln)

 

Originalpublikationen


Claus P, Grothe C. Molecular cloning and developmental expression of rat fibroblast growth factor receptor 3. Histochem Cell Biol 2001; 115:147-55.


Grothe C, Meisinger C, Claus P. In vivo expression and localization of the fibroblast growth factor system in the intact and lesioned rat peripheral nerve and spinal ganglia. J Comp Neurol 2001, 434:342-57.


Guntinas-Lichius O, Angelov DN, Tomov TL, Dramiga J, Neiss, WF, Wewetzer K. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 2001, 172:70-80.


Klinge PM, Groos S, Wewetzer K, Haastert K, Rosahl S, Vafa MA, Hosseini H, Samii M, Brinker T. Regeneration of a transected peripheral nerve by transplantation of spinal cord encapsulated in a vein. NeuroReport 2001, 12:1271-5.


Klinge P, Vafa MA, Brinker T, Brandis A, Walter GF, Stieglitz T, Samii M, Wewetzer K. Immunohistochemical characterization of axonal sprouting and reactive tissue changes after long-term implantation of a polyimide sieve electrode to the transected adult rat sciatic nerve. Biomaterials 2001, 22:2333-43.


Müller-Ostermeyer F, Claus P, Grothe C. Distinctive effects of rat fibroblast growth factor-2 isoforms on PC12 and Schwann cells. Growth Factors 2001, 19:175-91.


Wewetzer K, Grothe C, Claus P. In vitro expression and regulation of ciliary neurotrophic factor and its a receptor unit in neonatal rat olfactory ensheathing cells. Neurosci Lett 2001, 306:165-8.

 

Übersichtsartikel

Grothe C, Nikkhah G. The role of basic fibroblast growth factor in peripheral nerve regeneration. Anat Embryol 2001, 204:171-7.


Abstracts

2001 wurden 12 Abstrats publiziert.