Spektrale Karyotypisierung (SKY)

Die Aufklärung genetischer Veränderungen in Tumorzellen und das Verständnis ihrer Auswirkungen im Rahmen der Krebserkrankung sind nicht nur aus diagnostischer Sicht von entscheidender Bedeutung, sondern können langfristig die Grundlage zur Entwicklung neuer Therapieansätze darstellen.

Während der Entstehung von Krebserkrankungen tritt häufig eine Phase der chromosomalen Instabilität auf, in der sich chromosomale Veränderungen ausbilden, die für die Zelle einen Überlebensvorteil bringt. Sie können durch die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen zu einer defekten Zellzykluskontrolle oder DNA-Reparatur führen. Die Untersuchung chromosomaler Instabilitäten humaner Krebserkrankungen, insbesondere Erkrankungen des hämatopoetischen Systems mittels Bänderungstechniken wie der konventionellen G- oder R-Bandendarstellung sind seit Jahrzehnten etablierte Techniken in der zytogenetischen Diagnostik. Diese Methoden sind aufgrund der Ähnlichkeit aller Chromosomen zur Karyotypisierung von Mauschromosomen unzureichend. Dieses Problem konnte durch die im Jahr 1996 von Evelin Schröck et al. publizierte molekularzytogenetische Methode der spektralen Karyotypisierung (SKY) gelöst werden. Die Technik nutzt eine kombinatorische Fluoreszenzmarkierung, welche die simultane und farblich differenzierte Darstellung aller Chromosomen eines Chromosomensatzes erlaubt (Abb.1). Auf diese Weise können Chromosomen sehr einfach karyotypisiert, diskrete Umlagerungen detektiert, komplexe Veränderungen aufgeklärt und Markerchromosomen identifiziert werden. Die fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden sind kommerziell erhältlich (Applied Spectral Imaging, Migdal HaEmek, Israel). Für die Durchführung einer SKY sind qualitativ hochwertige Metaphase-Chromosomen in ausreichender Quantität erforderlich. Die Sensitivität der Methode wird daher nicht durch die spektrale Bildgebung limitiert, sondern eher durch die Probe selbst. Die Auflösung der SKY wird mit ca. 2Mb angegeben.

SKY-Analyse einer murinen Lymphomzelle. Detektion einer balancierten Translokation T(11;15), eines zusätzlichen deletierten Chromosoms 10 und einer Trisomie 17. In der Region 15D3 des murinen Genoms ist das Onkogen c-myc lokalisiert. Die Aktivierung des Onkogens durch die Translokation kann das Fortschreiten des Lymphoms fördern. (RGB =Falschfarbenbild, CL=Falschfarbenbild mit Klassifizierung, DAPI=4,6-Diamidino-2-phenylindol)

In verschiedenen murinen in vitro- und in vivo-Modellen der Leukämo- und Lymphomgenese konnten wir mithilfe der SKY chromosomale Instabilitäten nachweisen. So zeigten wir beispielsweise in Kooperation mit Prof. Dr. C. A. Schmitt (Abteilung Hämatologie/Onkologie, Charité, Berlin) in einem murinen in vivo-Modell zur Untersuchung der Funktion der Histon-Methyltransferase Suv39h1 in N-RAS-getriggerten Tumoren wiederkehrende chromosomale Defekte (Abb.2). Die Kombination aus genetischem und epigenetischem Defekt führte zu einer deutlich gesteigerten Aggressivität der Tumoren. Auffallend häufig wurden Bruchereignisse in der Region D2~D3 des Chromosoms 15 beobachtet, wobei verschiedene Translokationspartner involviert waren. Es ist zu vermuten, dass durch die Translokationen das in der Region 15D3 lokalisierte Onkogen c-Myc aktiviert wurde.

Die Histon-Methylierung ist grundlegend von der DNA-Methylierung zu unterscheiden. Dennoch sind beide epigenetischen Modifikationen vernetzt und induzieren die Ausbildung einer geschlossenen Chromatinstruktur mit nachfolgender Abschaltung der Transkription. Murine in vivo-Modelle demonstrieren einen kausalen Zusammenhang zwischen DNA-Hypomethylierung und genetischer Instabilität. Durch diese Veränderungen können die Zellen tumorigene Eigenschaften gewinnen, z.B. einen Differenzierungsstop oder die Verhinderung der Apoptose, was zur malignen Zelltransformation und zur Tumorprogression beitragen kann. Das verdeutlicht, dass auch mit der Inhibierung der DNA-Methylierung ein erhöhtes Risiko der Tumorinduktion einhergehen könnte.

DNA-demethylierende Agenzien wie 5-Azacytidin führen zu einer globalen Demethylierung CpG-reicher Promotorregionen, was zu Genaktivierungen führt. Die Reaktivierung epigenetisch inaktivierter Tumorsuppressorgene ist ein therapeutischer Ansatz, der bereits seit einigen Jahren in klinischen Studien Anwendung findet. Neben diesem gewünschten Effekt kann es darüber hinaus aber auch zur Aktivierung von Onkogenen als unerwünschten Nebeneffekt kommen. Derzeit ist völlig unklar, inwieweit die Hypomethylierung von Histonen und DNA, u.a. durch Behandlung mit demethylierenden Substanzen, die Entstehung von Chromosomenaberrationen begünstigt.

In Kooperation mit der Abteilung Experimentelle Hämatologie der MHH (Leitung: Prof. Dr. Christopher Baum) wird in einem laufenden Projekt untersucht, wie sich Defekte von DNA-Methylierungen bei gleichzeitiger Aktivierung von Onkogenen auf die Leukämieentstehung und die Induktion chromosomaler Instabilitäten auswirken. Hierzu werden murine Stammzellen isoliert, mit Onkogen-kodierenden retroviralen Vektoren transduziert und mit DNA-demethylierenden Substanzen wie 5-Aza-2´-deoxycytidin in verschiedenen Konzentrationen und definierten Zeiträumen behandelt. Diese Zellen können nachfolgend in Empfängertiere transplantiert werden. Die Tiere werden engmaschig auf Krankheitszeichen untersucht. Erkrankte Tiere werden euthanasiert. Die Diagnose wird histologisch und durchflusszytometrisch anhand der Klassifizierung für hämatologische Erkrankungen der Maus gestellt. Präparierte Knochenmarkzellen werden nach Kurzzeitkultur molekulargenetisch mittels SKY und Fluoreszenz- in situ-Hybridisierung (FISH) auf chromosomale Instabilität untersucht. Die Identifizierung dysregulierter Gene gelingt mit denen im Institut etablierten Techniken der Array-CGH (Array-basierte comparative genomische Hybridisierung) und cDNA-Microarray-Analysen. Der Methylierungsgrad einzelner Gene kann spezifisch mittels combined bisulfite restriction analysis (COBRA) bestimmt werden.

Letztlich kann ein genaueres Verständnis der Mechanismen, die zu einer erhöhten chromosomalen Instabilität führen, dazu beitragen die Induktion von chromosomalen Veränderungen und damit die Krebsentstehung zu verhindern – oder umgekehrt Krebszellen durch eine massive chromosomale Instabilität in den Zelltod zu treiben.

Mitarbeiter: Cornelia Rudolph, Tanja Hinrichsen, Brigitte Schlegelberger. Förderung: Deutsche Krebshilfe