Array-CGH
Die array-CGH wurde 1997 in der Arbeitsgruppe von Peter Lichter (DKFZ, Heidelberg) entwickelt und ermöglicht es, genomweite Veränderungen der DNA-Kopienzahl, entstanden durch den Zugewinn oder Verlust bestimmter Chromosomenregionen oder ganzer Chromosomen, sehr sensitiv zu erkennen. Diese Veränderungen können einige hundert bis mehrere Millionen Basenpaare betreffen. Im Gegensatz zu Expressionsarrays, bei denen üblicherweise c-DNAs oder 70mer Oligos gespottet werden, werden bei der array-CGH Plasmide, die grosse Fragmente genomischer DNA enthalten, sog. BAC oder PAC- Klone, oder auch 70mer Oligos auf Silan-beschichtete Glasobjektträger gespottet. Erstmals können so kleine Amplifikationen und Deletionen < 1MB erfasst und bekannte chromosomale Imbalancen in ihrer Struktur besser analysiert werden.
In der Krebsforschung wird die Array-CGH eingesetzt, um Veränderungen der Kopienzahl mit bestimmten Krebsarten in Verbindung zu bringen und damit diagnostische Tests, u.a. für die Vorhersage der Prognose, zu entwickeln. Die Identifizierung von systematisch deletierten oder amplifizierten Regionen in einer Gruppe von untersuchten Tumoren ermöglicht die Identifizierung von Genen, die bei der Tumorentstehung und -entwicklung eine Rolle spielen, da Tumorsuppressorgene in deletierten, Onkogene in amplifizierten Regionen zu vermuten sind.
Prinzip der Array-CGH:
Etwa gleiche Mengen der Tumor- und Referenz-DNA werden mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert und auf den Chip kohybridisiert. Numerische Veränderungen im Tumorgenom führen zu Verschiebungen im Hybridisierungsverhältnis und damit zu einer Farbverschiebung des Fluoreszenzsignals. Diese Farbverschiebung kann automatisiert erfasst und statistisch ausgewertet werden, sodass sich die Methode auch für 'high throughput' Analysen eignet.
Literatur:
Solinas-Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Dohner H, Cremer T, Lichter P. (1997) Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances Genes Chromosomes Cancer 20:399-407.
Wessendorf S, Fritz B, Wrobel G, Nessling M, Lampel S, Goettel D, Kuepper M, Joos S, Hopman T, Kokocinski F, Dohner H, Bentz M, Schwaenen C, Lichter P (2002) Automated screening for genomic imbalances using matrix-based comparative genomic hybridization. Lab Invest 82:47–60.
Array-CGH in der genetischen Diagnostik
Eine weitestgehende Automatisierung des Versuchsablaufes und der anschließenden Auswertung gewährleistet standardisierte und reproduzierbare Prozessabläufe für Routineanwendungen. Durch die Array-CGH ergeben sich neue Möglichkeiten für die Tumorzytogenetik und für prä- und postnatale genetische Analysen. Submikroskopische Microdeletionen und Microduplikationen sind häufige Ursache für syndromale Erkrankungen, die meist mit Fehlbildungen und mentaler Retardierung einhergehen. Die Detektionsrate chromosomaler Aberrationen kann mit dieser hochauflösenden Technologie deutlich verbessert werden.
Bisherige Array-CGH-Studien haben zu der Erkenntnis geführt, dass das menschliche Genom einen unerwartet hohen Anteil von Bereichen enthält, deren Kopienzahl bei phänotypisch normalen Menschen variiert. Die Größe dieser CNVs ('copy number variations') reicht von einigen Kilobasen bis zu mehreren Megabasen. Datenbanken, die solche Polymorphismen auflisten, sind noch sehr vorläufig und unvollständig (http://projects.tcag.ca/variation/).
Literatur:
Feuk L, Carson AR, Scherer SW. (2006) Structural variation in the human genome. Nat Rev Genet. 7:85-97
Vermeesch JR, Fiegler H, de Leeuw N, Szuhai K, Schoumans J, Ciccone R, Speleman F, Rauch A, Clayton-Smith J, Van Ravenswaaij C, Sanlaville D, Patsalis PC, Firth H, Devriendt K, Zuffardi O (2007) Guidelines for molecular karyotyping in constitutional genetic diagnosis.Eur J Hum Genet 15(11):1105-14. [E-pub ahead of print] [PubMed]
Charakterisierung von Maus-Modellen
Die Erstellung genomischer Profile der Maus kann mit Hilfe des Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide (MEEBO) Arrays (Stanford functional genomics facility) erfolgen. Dieser Chip besteht aus 38,784 70mer Sequenzen, die mittels einer Transkriptom-basierten Annotation von exonischen Sequenzen für genomische Loci ausgewählt wurden. Der gleiche Chip kann für die Hybridisierung von RNA benutzt werden, womit z.B. die Korrelation von Gendosis und Expression sowie die gesamte bioinformatische Analyse und Datenvalidierung erleichtert wird.
Um eine höhere Auflösung im humanen oder murinen System zu erreichen werden Arrays der Firma Agilent (www.chem.agilent.com) eingesetzt. Mit dem 244k Array beispielsweise kann eine genomweite Auflösung von ca. 10 Kilobasen erreicht werden.
Benötigte DNA-Mengen:
