Forschungsbericht 2007
I Forschungsprofil der Abteilung
Ziel unserer Forschungsprojekte ist die Aufklärung der grundlegenden Funktionsprinzipien
verschiedener Motorproteine sowie die Charakterisierung krankheitsrelevanter
Funktionsstörungen. Motorproteine sind Moleküle, die bei der Wechselwirkung mit
Zytoskelettstrukturen unter Verbrauch von ATP Kräfte und Bewegungen erzeugen.
Die Motorproteinfamilien der Myosine, Kinesine und Dyneine sind für nahezu alle Formen von
Transport und Bewegung in biologischen Systemen verantwortlich. Dazu agieren Motorproteine
entweder als individuelle Moleküle, wie z.B. bei intrazellulären Transportprozessen, oder sie
sind in komplexen Strukturen wie Myofibrillen oder Flagellen organisiert. Inzwischen sind
zahlreiche Erkrankungen bekannt, die auf Veränderungen in Motorproteinen zurückzuführen
sind. Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie, Tumorentstehung, degenerative
Erkrankungen der Motoneurone oder die Alzheimer-Demenz sind Beispiele für Auswirkungen
von Mutationen in Motorproteinen.
Durch unsere Forschungsprojekte wollen wir einerseits zur Aufklärung der molekularen
Mechanismen beitragen, durch die Motorproteine bei der Wechselwirkung mit ihren
Zytoskelettschienen gerichtete motile Kräfte erzeugen. Zum anderen wollen wir aufklären, wie
z.B. Mutationen in der Motordomäne des kardialen Myosins über Veränderungen der
Myosinfunktion zum Krankheitsbild der familiären hypertrophischen Kardiomyopathie führen
können. Die primären funktionellen Auswirkungen solcher Mutationen geben einerseits
Hinweise auf die funktionelle Bedeutung einzelner Strukturelemente der Myosinkopfdomäne.
Durch gezielte Veränderung dieser Strukturelemente und Expression der Konstrukte in
geeigneten nicht-muskulären Systemen, z.B. E. coli, Dictyostelium discoideum oder
Insektenzellen, kann die funktionelle Relevanz der einzelnen Strukturelemente systematisch
aufgeklärt werden. Andererseits können aus den primären funktionellen Auswirkungen
angeborener Mutationen Ansatzpunkte für korrigierende pharmakologische Beeinflussung der
primären Funktionsstörungen und des resultierenden Krankheitsbildes identifiziert werden.
Die genannten Ziele erfordern ein breites Spektrum experimenteller Ansätze, angefangen bei
vereinfachten zellulären Systeme wie Muskelfasern oder isolierte Herzmuskelzellen, deren
Membranen durch Behandlung mit Detergenzien entfernt wurden, um direkten Zugang zu den
kontraktilen Proteinen zu erreichen. Daneben kommen Untersuchungen an in vitro Assays zum
Einsatz, die aus isolierten Proteinen rekonstituiert werden. Damit können auch nichtmuskuläre
Myosine, Kinesine und Dyneine sowie in diese Proteine gezielt eingeführte Veränderungen
nach Expression und Aufreinigung funktionell charakterisiert werden. Darüber hinaus können in
solchen in vitro Assays auch am individuellen Einzelmolekül Kräfte und Schrittdistanzen
gemessen und über Fluoreszenzsignale mit der Bindung bzw. Abdissoziation einzelner
Substrat- und Produkt-Moleküle korreliert werden. Ein Schwerpunkt der Abteilung ist deshalb
die Entwicklung neuer methodischer Ansätze zur funktionellen Charakterisierung von
Motorproteinen auf Einzelmolekülebene.
II Forschungsprojekte:
Optical trap approach to study motor mechanics
An optical trap is generated by focussing a laser beam with an objective lens of high numerical
aperture. In a simplified explanation an object exposed to an optical trap will experience two
forces, a gradient force and the scattering force. While the scattering force pushes the object in
the direction of beam propagation, the gradient force pushes the object towards the center of
highest light intensity. Spherical objects such as beads will come to a stable position just below
the focus of the beam.
The development of optical trap technology has made it possible to investigate the action of
motor proteins at the single molecule level. Molecular motors are involved in a wide range of
processes for muscle contraction to organelle transport and cell division. Two assays have been
developed: a single bead assay and a two bead dumbbell approach. In a single bead approach
(Fig.1a) the motor is attached to a bead which is held in a weak optical trap and then presented
over a filament which had been attached to the surface. The action of the motor is then
observed by monitoring the position of the trapped bead. Due to the large size difference
between motor and trapped bead one only observes an effect of the motor after it has overcome
the compliance of the weak trap (Deltax in Fig. 1a). Therefore, the initial phase of the motorfilament
interaction (such as the working stroke of a single motor domain) will not be detected.
Because of this limitation only processive molecular motors can be studied via this approach
(Fig. 1b).
Figure 2. (a) Schematic dumbbell setup. (b) 10 secs of position records of left (top trace) and right bead
(bottom trace) of the dumbbell while interacting with a myosin head. (c) A plot of the standard deviation
versus the mean position of 5 msecs time slices of the data record in which the dumbbell passed 5 target
zones during 100 secs of data collection. (d) The “dumbell model” of optical trap experiments with
Hookean elastic elements: trap stiffnesses k1 and k2, actin-bead link stiffnesses kL1 and kL2 and myosin
head stiffness kM. Labels indicate trap positions xT1 and xT2, bead positions x1 and x2. The myosin head
binds to the actin filament at xM.
filament-bead link stiffnesses to myosin-surface and myosin-actin link stiffness. The filament-bead
stiffnesses are of particular importance when looking at the reduction of variance of bead
movement caused by the binding of the motor head as illustrated in Figure 2b. Different link
chemistry had been used to bind the actin filament to the bead surface. In one case (top trace
Fig. 2b) the plus-end of an actin filament had been bound to the surface, while the second bead
had been attached to the other end of the filament laterally (bottom trace Fig. 2b).
We have used two approaches to determine the myosin stiffness. In one approach we extracted
the motor stiffness from the variance and co-variance of the movements of the trapped bead
when a motor is attached and detached from the dumbbell. In a second approach we extracted
the motor stiffness from the combined stiffness of the dumbbell (Fig. 2d) by measuring the
stiffness of both traps and the stiffnesses for both filament-bead links. In both approaches we
determined the myosin motor stiffness to be ~2 pN/nm matching closely measurement from
whole muscle fibres. Employing the dumbbell approach we will continue exploring actin-based
motors as well as microtubule-based motors. We expect a new insight into the action of single
motor domains as well as the coordination between motor domains during a processive
movement.
Projektleiter: Steffen W; Kooperationspartner: Lewalle A, Sleep J, King's College London, UK.
Förderung: DFG
III Weitere Forschungsprojekte
(I) Familiäre Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM)
Charakterisierung der funktionellen Auswirkungen von HCM-assoziierten Mutationen in
der Myosin-Kopfdomäne. Biomechanische Untersuchungen an Muskelfasern aus M.
soleus-Biopsien von HCM-Patienten.
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Matinmehr F, Piep B, Kirschner S, Seebohm B, Vujevic D.
Kooperationen: Navarro-Lopez F, Hospital Clinic, Barcelona, Spanien; AG Öczelik, C, Charité,
Berlin; McKenna W, The Heart Hospital, University College London, UK; Förderung: DFG, EU
Funktionelle Auswirkung von HCM-assoziierten Myosinmutationen charakterisiert an
einzelnen, permeabilisierten Kardiomyozyten aus explantiertem Myokard transplantierter
HCM-Patienten
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Piep B, Beier T, Lingk A. Kooperationen: Navarro-Lopez F,
Hospital Clinic, Barcelona, E; Stienen G, Freie Universität Amsterdam, NL; Förderung:
Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU
Quantifizierung des Anteils an mutierter kardialer Myosin-Isoform auf mRNA und Protein-Ebene
in mykardialem Gewebe und Soleusbiopsien von HCM-Patienten
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Tripathi S, Becker E. Kooperation mit Pich A, Toxikologie,
MHH. Förderung: DFG
Funktionelle Auswirkungen von HCM-assoziierten Mutationen in Troponin I
Projektleiter: Brenner B; Mitarbeiter: Kraft T, Khoroshev M. Kooperation: Chalovich JM, East
Caroline University, NC, USA.
(II) Molekulare Mechanismen zur Erzeugung von Kräften und Bewegungen im quergestreiften Muskel
Auswirkung der Anreicherung von Phosphat auf Kraftentwicklung und
Querbrückenkinetik einzelner, permeabilisierten Kardiomyozyten der Ratte
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Schmell, S, Piep B, Beier T, Lingk A.; Förderung: Braukmann-Wittenberg-
Herz-Stiftung, EU
Untersuchungen zur Kontraktilität einzelner, intakter Kardiomyozyten aus Primärkultur
bzw. nach Differenzierung aus ES-Zellen
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Schmell, S, Piep B, Beier T, Lingk A. Kooperationen:
Niederbichler A, Klinik f. Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, MHH; Martin U,
LEBAO, MHH; Förderung: Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU
Strukturumlagerungen in der Myosinkopfdomäne bei aktiver Kraftentwicklung und
Verkürzung. Zeitaufgelöste 2D-Röntgenstrukturanalyse an isolierten Muskelfasern
mittels Synchrotronstrahlung.
Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Brenner B, Radocaj A; Förderung: DFG
Funktionelle und strukturanalytische Charakterisierung bisher nicht identifizierter
Zwischenzustände der Myosin-ATPase des quergestreiften Muskels mittels BTS, einem
Hemmstoff der aktiven Kraftentwicklung.
Projektleiter: Kraft T, Brenner, B; Mitarbeiter: Radocaj A, Lingk A, Piep B; Kooperation:
Manstein D, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH. Förderung: DFG ; HASYLAB, Deutsches
Elektronensynchrotron, Hamburg.
Wirkungsmechanismen kleinmolekularer Hemmstoffe auf aktive Kräfte und
Querbrückenkinetik.
Projektleiter: Brenner B; Kooperation: Manstein D, Institut für Biophysikalische Chemie, MHH
(III) Funktionelle Charakterisierung von Motorproteinen auf Einzelmolekülebene
Charakterisierung der Hydrolyse von ATP am individuellen Myosin-Molekül mittels
Evanescent Field (TIRF) Mikroskopie
Projektverantwortlich: Brenner B; Mitarbeiter: Amrute M; Kooperation: Kojima H, Oiwa K, KARC,
Kobe, Japan; Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg. Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular
Mechanisms of Cell Motility'.
Charakterisierung prozessiver Myosine mittels TIRF-Mikroskopie, Laserfalle und
Photonic Force Mikroskopie
Projektverantwortlich: Brenner B. Mitarbeiter: Schweda A, Amrute M, Uta P. Kooperation:
Manstein D, Tsiavaliaris G, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG-Forschergruppe
'Molecular Mechanisms of Cell Motility'
Alternative mechanochemische Reaktionszyklen prozessiver Kinesine
Projektleiter: Scholz T, Mitarbeiter: Hinrichs M, Uta P; Kooperationen: Johnson K, Univ. Texas,
Austin, Texas, USA, Manstein D, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH, Mandelkow E, MPI-ASMB,
Hamburg,; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'
Effekte verschiedener Isoformen des Tau-Proteins auf die Motilität einzelner
Kinesinmoleküle
Projektleiter: Scholz T. Mitarbeiter: Uta P.; Kooperationen: Sadananda A, Tata Institute of
Fundamental Research, Mumbai, Indien; Mandelkow EM, Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg;
Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'
Mechanische Charakterisierung einzelner Myosin- und Kinesinmoleküle mit dem
Photonischen Kraftmikroskop
Projektleiter: Scholz T. Mitarbeiter: Brenner B. Kooperationen: Hörber H, University of Bristol,
UK, Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg.
Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der optischen
Falle.
Projektleiter: Walter Steffen; Mitarbeiter: Wilhelm Walter; Stephan Lewark, Kooperationspartner:
Michael Koonce, Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Förderung: DFG
3-D Rekonstruktion von Dynactin einem essentiellen Regulatorkomplex des
cytoplasmatischen Dyneins.
Projektleiter: Walter Steffen; Kooperationspartner: Carsten Peters, Birkbeck College, London,
UK; Julie Hodgkinson, Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, UK
Originalpublikationen
Quantification of Mutant versus Wild-Type Myosin in Human Muscle Biopsies Using Nano-LC/ESI-MS, Edgar Becker, Francisco Navarro-López, Antonio Francino, Bernhard Brenner and Theresia Kraft, Anal. Chem. 2007, 79,9531-9538 pdf-download
Inorganic phosphate binds to the empty nucleotide binding pocket of conventional myosin II,
Mamta Amrute-Nayak, Massimo Antognozzi1, Tim Scholz, Hiroaki Kojima, and Bernhard Brenner, JBC Papers in Press, Dez. 2007 pdf-download
A microtubule-based, dynein-dependent force induces local cell protrusions: Implications for neurite initiation. Dehmelt L, Nalbant P, Steffen W, Halpain S.,
Brain Cell Biol. 2007 Feb;35(1):39-56. Epub 2007 Mar 13. PMID: 17940912 [Abstract PubMed]
Single Molecule Measurement of the Stiffness of the Rigor Myosin Head. Lewalle A, Steffen W, Stephenson O, Ouyang Z, Sleep J.,
Biophys J. 2007 Dec 7; [Epub ahead of print], PMID: 18065470 [Pubmed Abstruct]
Abstracts
2007 wurden 7 Abstracts publiziert.
Promotionen
Carsten Peters, Three-dimensional reconstruction of the dynactin complex and its implication
for the dynein/dynactin mediated transport.
Ante Radocaj, (Dr. rer. nat.) Structural states associated with the power stroke of myosin heads in muscle: a 2D-X-ray diffraction study.
Weitere Tätigkeiten in der Forschung
Brenner B (Prof. Dr. med.): Koordinator des DFG-Schwerpunktes „Molekulare Motoren“ (SPP 1068), Gutachter für DFG, Medical Research Council UK, diverse Zeitschriften.
Kraft T (Prof. Dr. rer. nat): Gutachterin für DFG und diverse Zeitschriften.
Steffen W (PD Dr. rer. nat): Gutachter für diverse Zeitschriften.