Forschungsbericht 2006

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I. Forschungsprofil der Abteilung

 

Ziel unserer Forschungsprojekte ist einerseits die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die bei Wechselwirkung von Motorproteinen mit ihren Zytoskelettschienen unter Hydrolyse von ATP zu gerichteten motilen Kräften führen. Die Motorproteinfamilien der Myosine, Kinesine und Dyneine sind für nahezu alle Formen von Transport und Bewegung in biologischen Systemen verantwortlich. Dazu agieren sie entweder als individuelle Moleküle, wie z.B. bei intrazellulären Transportprozessen, oder sie sind in komplexen Strukturen wie Myofibrillen oder Flagellen organisiert. Inzwischen sind zahlreiche Erkrankungen bekannt, die auf Mutationen in Motorproteinen zurückzuführen sind. Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie, Tumorentstehung, degenerative Erkrankungen der Motoneurone oder die Alzheimer-Demenz sind Beispiele für Auswirkungen von Mutationen in Motorproteinen. Unsere Forschungsprojekte zielen deshalb andererseits darauf, funktionelle Auswirkungen von Mutationen in Myosin-, Kinesin- und Dynein-Molekülen zu charakterisieren, die primäre Ursache klinischer Krankheitsbilder sind. Ein Beispiel sind Mutationen in der Myosinkopfdomäne, die im Rahmen der Familiären Hypertrophischen Kardiomyopathie identifiziert wurden. Die primären Auswirkungen solcher Mutationen zu erkennen gibt einerseits Hinweise auf die funktionelle Bedeutung einzelner Strukturelemente der Myosinkopfdomäne, andererseits können Ansatzpunkte für korrigierende pharmakologische Beeinflussung der primären Funktionsstörungen identifiziert werden. In einem weiteren Schritt können diese Strukturelemente dann gezielt verändert und die Konstrukte in geeigneten nicht-muskulären Systemen, z.B. E. coli, Dictyostelium discoideum oder Insektenzellen exprimiert werden, um die funktionelle Relevanz einzelner Strukturelemente systematisch aufzuklären.

 

Die genannten Ziele erfordern ein breites Spektrum experimenteller Ansätze, beispielsweise vereinfachte zelluläre Systeme wie Muskelfasern oder isolierte Herzmuskelzellen, deren Membranen durch Behandlung mit Detergenzien entfernt wurden, um direkten Zugang zu den kontraktilen Proteinen zu gewährleisten. Daneben kommen Untersuchungen an in vitro Assays zum Einsatz. Mit solchen in vitro Assays, die aus isolierten Proteinen rekonstituiert werden, können auch nichtmuskuläre Myosine, Kinesine und Dyneine sowie gezielte Mutationen in diesen Proteinen nach Expression und Aufreinigung funktionell charakterisiert werden. Darüber hinaus können in solchen in vitro Assays auch am individuellen Einzelmolekül Kräfte und Schrittdistanzen gemessen und über Fluoreszenzsignale mit der Bindung bzw. Abdissoziation einzelner Substrat- und Produkt-Moleküle korreliert werden. Ein weiterer Schwerpunkt der Abteilung ist deshalb die Entwicklung neuer methodischer Ansätze zur funktionellen Charakterisierung von Motorproteinen auf Einzelmolekülebene.

 

 

II. Forschungsprojekte

 

1.) Funktionelle Charakterisierung individueller Motorprotein-Moleküle mittels Evanescent Field (TIRF) Mikroskopie

 

Die Evanescent Field Mikroskopie ist eine Sonderform der Fluoreszenzmikroskopie. Dabei wird das Phänomen benutzt, dass bei Totalreflexion eines Lichtstrahls an der Grenzschicht von einem optisch dichteren Medium (z.B. Deckglas) zu einem optisch dünneren Medium (z.B. wässrige Lösung) auch im optisch dünneren Medium Lichtintensität zu beobachten ist. Diese klingt jedoch über eine Distanz von 200-300nm exponentiell ab. Dieses bei Totalreflexion im optisch dünneren Medium über kurze Distanz abklingende elektromagnetische Feld wird auch 'evaneszentes' Feld genannt. Daher die Bezeichnung Evanescent Field Mikroskopie oder TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence)-Mikroskopie.

Durch das Abklingen des elektromagnetischen Feldes im optisch dünneren Medium bleibt eine Fluoreszenzanregung im evaneszenten Feld auf eine ca. 200-300nm dünne und unmittelbar an die Deckglasoberfläche angrenzende Schicht begrenzt. Damit können Fluorophore, die im optisch dünneren, wässrigen Medium verteilt sind selektiv in dieser dünnen Grenzschicht angeregt werden; d.h. diffuse Hintergrundfluoreszenz von Fluorophoren außerhalb dieser Grenzschicht kann somit praktisch komplett unterdrückt werden. Durch die Reduktion der Hintergrundfluoreszenz können deshalb selbst individuelle Fluorophormoleküle wie GFP (Greene fluorescent protein) oder Cy3, als Beispiel eines organischen Fluorophors, detektiert werden.

 

Wir setzen dieses Prinzip der Fluoreszenzmikroskopie ein, um beispielsweise die Fortbewegung einzelner fluoreszenzmarkierter Motorproteine an ihrer Zytoskelettstruktur (z.B. eGFP-markiertes Kinesin an einem Mikrotubulus) zu verfolgen oder die Zeit von der Bindung eines fluoreszenzmarkierten ATP-Moleküls (Cy3-ATP) an ein Motorprotein (z.B. Myosin) bis zur Abdissoziation als Cy3-ADP nach Spaltung im aktiven Zentrum zu messen. Abb. 1 zeigt schematisch das Prinzip der Evanescent Field Mikroskopie und den Einsatz für die beiden genannten Fragestellungen.

 

Für solche Untersuchungen haben wir ein Evanescent Field Mikroskop in der Konfiguration eines Umkehrmikroskops aufgebaut. Das evaneszente Feld wird dadurch erzeugt, dass die Laser für Fluoreszenzanregung (488nm, 532nm und 633nm) ähnlich der Anregung bei Auflichtfluoreszenz in das Objektiv eingekoppelt werden. Die Anregungslaser sind allerdings soweit parallel zur optischen Achse verschoben, dass sie an der Grenzschicht zwischen Deckglas und wässrigem Medium total- und ins Objektiv zurück-reflektiert werden (vgl. Abb. 2). Um einen Einfallswinkel über dem kritischen Winkel "ThetaC" für Totalreflexion erreichen zu können, muss Ölimmersion eingesetzt werden und die numerische Apertur des Objektivs >= 1.40 sein.

Individuelle Fluorophore detektieren zu können erlaubt direkt die Frage anzugehen, ob ein Motorprotein in der Lage ist, an der zugehörigen Zytoskelettstruktur über längere Distanzen entlang zu wandern und beispielsweise Vesikel zu transportieren, ohne von dieser Schiene abzudissoziieren. Dies ist in Abb. 3 (A) für ein Konstrukt des konventionellen Rattenkinesins gezeigt, das über Fusion mit einem eGFP-Molekül fluoreszenzmarkiert war. Aus der 'Fortbewegung' der Fluoreszenzsignale lassen sich dann direkt Laufdistanzen bis zur Abdissoziation und Laufgeschwindigkeiten bestimmen. Durch Anpassen von 2D-Gauss-Funktionen an das Fluoreszenzsignal lässt sich die Position der Fluorophore auf wenige Nanometer genau verfolgen. Damit lassen sich dann auch einzelne Schritte auflösen und Schrittweite oder Schrittabfolge bei der Fortbewegung eines einzelnen Moleküls direkt charakterisieren.

Wir nutzen diesen Ansatz, um im Rahmen der DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility' der Frage nachzugehen, welche molekularen Eigenschaften Voraussetzung sind, damit sich die Moleküle mancher Motorproteine ohne Abdissoziation viele Schritte an ihrer Zytoskelettstruktur entlang bewegen können, andere sich dagegen nach jedem Schritt ablösen und nur in einer größeren Gruppe Transport- oder Bewegungsfunktion erfüllen können.

 

Im zweiten Ansatz (vgl. Abb. 3B, C) nutzen wir die Möglichkeit individuelle Fluorophore verfolgen zu können, um Einblick in die Reaktionskinetik von ATP-Bindung, seiner Spaltung und Abdissoziation als ADP von einzelnen Motorproteinen zu verfolgen. Dazu benutzen wir fluoreszenzmarkiertes ATP (Cy3-ATP), das bei geeignetem Ankoppeln des Fluorophors von den Motorproteinen nach wie vor als Substrat genutzt werden kann. Werden nur ganz wenige Motorproteinmoleküle auf einem Deckglas z.B. über Anti-His-Antikörper immobilisiert, so treten nur an einigen wenigen Positionen im Sehfeld wiederholt Fluoreszenzsignale auf. Mit Motorproteinmolekülen, die selbst mit einem Fluorophor anderer Absorption/Emission als das Cy3-ATP markiert sind, lässt sich zeigen, dass die einzelnen Positionen im Sehfeld, and denen wiederholt Cy3-ATP-Signale auftreten, individuellen Motorproteinmolekülen entsprechen. Mit diesem Ansatz kann dann von jedem einzelnen Motormolekül eine Vielzahl (>100) von Einzelereignissen aus Bindung, Spaltung und Abdissoziation einzelner Cy3-ATP Moleküle zugeordnet werden. Ein solches Einzelereignis ist in Abb. 3B dargestellt. Zu beachten sind einstufiges 'An'- und 'Abschalten' des Fluoreszenzsignals als Signatur eines Einzelereignisses, d.h. einer Abfolge von Bindung eines Cy3-ATP-Moleküls, seiner Spaltung und Abdissoziation als Cy3-ADP. In Abb. 3C sind alle Einzelereignisse eines einzelnen Motorproteinmoleküls zusammengefasst, um das 'Abschaltverhalten' der Fluoreszenzsignale zu charakterisieren. Die angefittete zweigliedrige Exponentialfunktion zeigt, dass die Dauer der Einzelereignisse zwei Populationen zuzuordnen ist, obwohl sie von einem einzigen Molekül stammen. D.h. Bindung und Spaltung eines Cy3-ATP-Moleküls mit nachfolgender Abdissoziation als Cy3-ADP folgt auch bei einem einzelnen Motorproteinmolekül nicht immer der gleichen Reaktionskinetik. Ob dies auf Umlagerungen des Einzelmoleküls zwischen zwei (oder mehreren) Konformeren mit unterschiedlicher Enzymkinetik zurückzuführen ist, wie für manche Enzyme bereits postuliert, oder ob im Einzelmolekül alternative Reaktionswege beschritten werden können, kann erst durch weitere Experimente geklärt werden. Die eindeutige Zuordnung beider Populationen von Einzelereignissen zu einem einzelnen Molekül ist allerdings erst durch den Einsatz der Evanescent Field Mikroskopie möglich, mit der individuelle Moleküle bei ihrer Funktion direkt verfolgt und Fluoreszenzsignale individuellen Molekülen zugeordnet werden können.

 

Parallel mehrere individuelle Moleküle pro Sehfeld in ihrer Funktion verfolgen zu können erlaubt auch, in Gemischen verschiedener Isoformen, oder bei Coexpression von Mutanten und Wildtypformen die Funktion der einzelnen Isoform bzw. der mutierten Moleküle im direkten Vergleich mit Wildtypmolekülen zu analysieren, bzw. gegebenenfalls die Funktion von Homo- und Heterodimeren direkt zu vergleichen.

Projektverantwortlich: Brenner B; Mitarbeiter: Luckhaus D, Amrute M, Lampe M.; Kooperation: Kojima H, Oiwa K, KARC, Kobe, Japan; Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg. Förderung: DFG.

 

 

III. Weitere Forschungsprojekte

 

 

2.) Familiäre Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM)

 

Funktionelle Untersuchungen an einzelnen Muskelfasern aus Biopsien des M. soleus von HCM-Patienten mit Mutationen in der Myosin-Kopfdomäne

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Matinmehr F, Piep B, Kirschner S, Seebohm B, Vujevic D. Kooperationen: Navarro-Lopez F, Hospital Clinic, Barcelona, Spanien; AG Öczelik, C, Charité, Berlin; McKenna W, The Heart Hospital, University College London, UK; Förderung: DFG, EU

 

Funktionelle Auswirkung von HCM-assoziierten Myosinmutationen charakterisiert an einzelnen, permeabilisierten Kardiomyozyten aus explantiertem Myokard transplantierter HCM-Patienten

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Piep B, Beier T, Lingk A. Kooperationen: Navarro-Lopez F, Hospital Clinic, Barcelona, E; Stienen G, Freie Universität Amsterdam, NL; Förderung: Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU

 

Quantifizierung des Anteils an mutierter kardialer Myosin-Isoform auf mRNA und Protein-Ebene in mykardialem Gewebe und Soleusbiopsien von HCM-Patienten

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Tripathi S, Becker E. Kooperation mit Pich A, Toxikologie, MHH. Förderung: DFG

 

Analyse der Enzymkinetik von Myosinmutanten aus Soleusbiopsien von HCM-Patienten mittels Flash-Photolysis-Spektroskopie

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Olling A; Kooperation: Manstein D, Chizhov I, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH.

 

Untersuchungen an isolierten Kardiomyozyten aus dem linken Ventrikel von Rattenherzen zur Charakterisierung der Auswirkung intrazellulärer Phosphatanreicherung auf die kontraktilen Kräfte

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Schmell, S, Piep B, Beier T, Lingk A. Kooperationen: Niederbichler A, Klinik f. Plastische, Hand- und Wiederherstellungschirurgie, MHH; Förderung: Braukmann-Wittenberg-Herz-Stiftung, EU

 

Funktionelle Auswirkungen von HCM-assoziierten Mutationen in Troponin I

Projektleiter: Brenner B; Mitarbeiter: Kraft T, Khoroshev M. Kooperation: Chalovich JM, East Caroline University, NC, USA.

 

 

3.) Molekulare Mechanismen zur Erzeugung von Kräften und Bewegungen im quergestreiften Muskel

 

Strukturumlagerungen in der Myosinkopfdomäne bei aktiver Kraftentwicklung und Verkürzung. Zeitaufgelöste 2D-Röntgenstrukturanalyse an isolierten Muskelfasern mittels Synchrotronstrahlung.

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Brenner B, Radocaj A; Förderung: DFG

 

Funktionelle und strukturanalytische Charakterisierung verschiedener Zwischenzustände (z.B. ADP.Pi-Zustände) des Myosin-ATPase Zyklus mittels Vanadat als Phosphat-Analogon.

Projektleiter: Kraft T; Mitarbeiter: Mählmann E, Radocaj A, Lingk A, Piep B; Förderung: DFG; HASYLAB, Deutsches Elektronensynchrotron, Hamburg.

 

 

4.) Funktionelle Charakterisierung von Motorproteinen auf Einzelmolekülebene

 

Charakterisierung prozessiver Myosine mittels Laserfalle, Photonic Force Mikroskopie und AFM-Technik

Projektverantwortlich: Brenner B. Mitarbeiter: Rydel-Koenecke K, Scholz T, Luckhaus D, Uta P. Kooperation: Manstein D, Tsiavaliaris G, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'

 

Alternative mechanochemische Reaktionszyklen prozessiver Kinesine

Projektleiter: Scholz T, Mitarbeiter: Hinrichs M, Koch P, Uta P; Kooperationen: Johnson K, Univ. Texas, Austin, Texas, USA, Manstein D, Abt. Biophysikalische Chemie, MHH, Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg,; Förderung: DFG-Forschergruppe 'Molecular Mechanisms of Cell Motility'

 

Mechanische Charakterisierung einzelner Myosin- und Kinesinmoleküle mit dem Photonischen Kraftmikroskop

Projektleiter: Scholz T. Mitarbeiter: Brenner B. Kooperation: Hörber H, University of Bristol, UK; Mandelkow E, MPI-ASMB, Hamburg; Cammarato A, San Diego State University, San Diego, USA

 

Charakterisierung der Motormechanik einzelner Dyneinmoleküle mit Hilfe der optischen Falle.

Projektleiter: Walter Steffen; Mitarbeiter: Wilhelm Walter; Stephan Lewark, Kooperationspartner: Michael Koonce, Wadsworth Center, Albany, NY, USA; Förderung: DFG

 

3-D Rekonstruktion von Dynactin einem essentiellen Regulatorkomplex des cytoplasmatischen Dyneins.

Projektleiter: Walter Steffen; Kooperationspartner: Carsten Peters, Birkbeck College, London, UK; Julie Hodgkinson, Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, UK

 

 

IV. Publikationen

 

1. Originalpublikationen

 

Brenner B. The stroke size of myosins: a reevaluation. J Muscle Res Cell Motil. 2006; 27:173-87.

 

Kopp P, Lammers R, Aepfelbacher M, Woehlke G, Rudel T, Machuy N, Steffen W, Linder S.

The kinesin KIF1C and microtubule plus ends regulate podosome dynamics in macrophages. Mol Biol Cell 2006; 17:2811-23. 2006.

 

Setter PW, Malvey-Dorn E, Steffen W, Stephens RE, Linck RW. Tektin interactions and a model for molecular functions. Exp Cell Res 2006; 312:2880-96

 

Schramm B, de Haan CA, Young J, Doglio L, Schleich S, Reese C, Popov A, Steffen W, Schroer T, Krijnse-Locker J. Vaccinia-Virus-Induced Cellular Contractility Facilitates the Subcellular Localization of the Viral Replication Sites. Traffic 2006; 7:1352-67

 

 

2. Buchbeiträge

 

Hodgkinson JL, Steffen W. Direct labeling of components in protein complexes by immuno-electron microscopy. In: Celis JE, editor. Cell Biology & Laboratory Handbook, 3rd edition. Academic Press; 2006. Vol. 3, p. 307-12

 

Steffen W, Lewalle A, Sleep J. Optical Tweezers: Application to the study of motor proteins. In: Celis JE, editor. Cell Biology & Laboratory Handbook, 3rd edition. Academic Press; 2006. Vol. 3, p. 37-45

 

 

3. Abstracts

 

2006 wurden 9 Abstracts publiziert.

 

 

V. Promotionen und Diplomarbeiten

 

Amrute M (Dr. rer. nat.). Studies on the ATP-Hydrolysis Cycle of Myosin II at the Ensemble and Single Molecule Level using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy.

 

Koch P (Dipl. Biochem.). Untersuchung eines Kinesinkonstruts auf Einzelmolekülebene mittels TIRF-Mikroskopie.

 

Schmell S (Dipl. Biol.). Etablierung einer Aufreinigungsmethode eines einzelköpfigen, rekombinanten Fragments des zytoplasmatischen Dyneins aus Dictyostelium discoideum.

 

 

VI. Weitere Tätigkeiten in der Forschung

 

Brenner B: Koordinator des DFG-Schwerpunktes „Molekulare Motoren“ (SPP 1068), Gutachter für DFG, Medical Research Council UK, MURST Italien, diverse Zeitschriften.

 

Kraft T: Gutachterin für DFG und diverse Zeitschriften.

 

Steffen W: Gutachter für diverse Zeitschriften.