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Einzelmolekülmotilität von Motorproteinen und MAPs

SINGLE MOLECULE MOTILITY GROUP – Dr. Tim Scholz


 

Ein weiterer Schwerpunkt der Abteilung ist die funktionelle Charakerisierung von Kinesinen, Myosinen und Dynein auf Einzelmolekülebene. Der intrazelluläre Transport z.B. in Nervenzellen, die Trennung der replizierten Chromosomen während der Zellteilung, das Schlagen von Flagellen und Zilien sowie die Muskelkontraktion vielzelliger Lebewesen sind Beispiele für Bewegungen von und in lebenden Organismen. Sie basieren auf der zyklischen Interaktion der Motorproteine Kinesin , Myosin und Dynein mit Strukturproteinen des Zytoskeletts wie Aktin und Tubulin.
Motorproteine der Kinesinfamilie sind Mikrotubuli-aktivierte ATPasen. Sie bewegen sich entlang von Mikrotubuli, röhrenförmigen Strukturen des Zytoskellets. Diese werden aus Protofilamenten gebildet, die durch Polymerisation von α/β-Tubulin-Heterodimeren entstehen. Das konventionelle Kinesin (auch Kinesin-1, Abbildung 1) wurde ursprünglich in Riesenaxonen von Tintenfischen entdeckt, wo es für den Vesikeltransport in die Zellperipherie der Nervenzellen zuständig ist. Im Gegensatz zum muskulären Myosin-2 ist das konventionelle Kinesin ein prozessives Motormolekül. Das heißt, es kann Hunderte von 8 nm langen Schritten, entsprechend der Größe eines α/β-Tubulin-Heterodimers, entlang eines Mikrotubulus machen, ohne von diesem zu dissoziieren. Vermutlich jeder Schritt ist dabei an die Hydrolyse eines Moleküls ATP gekoppelt. Die Fähigkeit von Kinesin, lange Strecken entlang von Mikrotubuli zu wandern, ohne von diesen zu dissoziieren, ist für seine biologische Funktion als Langstreckentransporter äußerst wichtig. Jedoch ist noch nicht im Detail geklärt, wie Kinesinmoleküle ihre beiden Motordomänen dafür koordinieren oder wie die Laufrichtung von Kinesinmolekülen bestimmt wird.

 

Abb. 1: Konventionalles Kinesin-1 (nach Kozielski, Mandelkow, Cell, 1997)

 

Möglichkeiten zur Untersuchung dieser Fragen bieten hier Messungen auf der Ebene einzelner Moleküle. Eine dafür sehr gut geeignete Technik ist die TIRF- (Total Internal Reflection Fluorescence) oder Evanescent wave Mikroskopie. Mit ihr lassen sich z.B. einzelne fluoreszenzmarkierte ATP- und Motormoleküle detektiertieren und deren Bewegungen verfolgen. So kann die Bewegung einzelner Motormoleküle mit der Bindung und Hydrolyse von fluoreszenzmarkiertem ATP korreliert werden. Diese Assays erlauben uns auch, funktionelle Auswirkungen gezielt eingeführter Mutationen in den Motorproteinen zu charakterisieren. Damit kann die funktionelle Relevanz einzelner Strukturelemente sowie die strukturelle Basis der Kommunikation zwischen den einzelnen Domänen der Motorproteine abgeleitet werden.

 

Movie 1: Einzelmolekülassay Kinesin-1 auf einem Mikrotubulus

 

Movie 1 zeigt ein Beispiel für die ATP-getriebenen prozessiven Bewegungen einzelner, fluoreszenzmarkierter Kinesinmoleküle (grün) auf einem immobilisierten, ebenfalls fluoreszenzmarkierten Mikrotubulus (rot).

 

 

Abb. 2: (A) Momentaufnahme einzelner sich bewegender Kinesin-1 Moleküle (grün) entlang eines immobilisierten markierten Mikrotubulus (Länge 34 µm, rot) in Gegenwart von ATP. (B) Ein einzelnes Kinesinmolekül (grün) bewegt sich prozessiv entlang des immobilisierten Mikrotubulus. (C) Gerichtete Bewegungen der einzelnen Kinesinmoleküle sind in einem Positions-Zeit-Plot (Kymograph) als nach rechts abweichende (grüne) Linien zu erkennen (Laufgeschwindigkeit 500-600 nm/s).

 

 

Movie 2: Mikrotubuli-Gleitassay

 

In Movie 2 ist ein Mikrotubuli-Gleitassay zu sehen, bei dem fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli (rot) unter ATP-Verbrauch auf einem Rasen immobilisierter Kinesinmoleküle (nicht sichtbar) bewegt werden.

 

RGBV-Faseroptik für TIRF-Mikroskopie und Biophotonik. BioPhotonik. Krischke, A., Oechsner, U., Knothe, C., Federau, G., Brenner, B., und Scholz, T. (2012). 1/2012, 22-26. Link (778 KB)

Letzte Änderung 21.02.2012 (uk)