Forschungsbericht 1998
Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie (FHC):
Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung von Punktmutationen in der ß-kardialen Isoform der schweren Ketten des Myosins bei Patienten mit FHC
(1) Korrelation zwischen Struktur und Funktion des Myosin-Kopfes: Mechanische Untersuchungen an Muskelfasern mit mutiertem Myosin von Patienten mit Familiärer Hypertrophischer Kardiomyopathie.
In den letzten Jahren konnten als Ursache für zahlreiche Fälle von Familiärer Hypertrophischer Kardiomyopathie (FHC) Punktmutationen in der Kopfdomäne der schweren Kette von Myosin 1 (MHC1) identifiziert werden. Wir untersuchen derzeit funktionelle Auswirkungen solcher Mutationen, die als primäre Ursache der Krankheit erachtet werden. Da die kardiale MHC1-Isoform auch in langsamer Skelettmuskulatur exprimiert wird, können diese Untersuchungen an Skelettmuskel-Biopsien von Patienten mit FHC durchgeführt werden. Wir messen die aktive Kraftentwicklung, die Geschwindigkeitskonstante des Kraftwiederanstiegs nach einer Verkürzungsphase, die maximale lastfreie Verkürzungsgeschwindigkeit, die Fasersteifheit unter Relaxation sowie die Kraft-Geschwindigkeits-Beziehung von einzelnen Muskelfasern mit Myosin-Mutation und von normalen Kontrollfasern. Derzeit untersuchen wir Biopsie-Material eines Patienten mit der Mutation ARG719TRP im Myosinkopf sowie eines Patienten mit der Mutation ARG453CYS. Eine vorläufige Analyse der Ergebnisse ergab nur für die ARG719TRP Mutation erste Hinweise auf veränderte aktive Kraftentwicklung, möglicherweise mit Veränderung der Calziumsensitivität. Für andere Mutationen konnten noch keine sicheren Hinweise auf Veränderungen der oben erwähnten Parameter festgestellt werden. Ursache für fehlende Effekte könnte sein, daß entweder die untersuchten Fasern nur relativ wenig mutiertes Myosin enthalten (es erfolgt Co-Expression von Wildtyp und Mutante), oder aber daß andere, bisher noch nicht untersuchte Eigenschaften der Fasern verändert sind.
Mitarbeiter: Jan Köhler, Theresia Kraft.
Förderung: DFG
(2) Auswirkungen von natürlich vorkommenden Mutationen im Bereich des Myosinkopfes auf die Gleitgeschwindigkeit fluoreszenzmarkierter Aktinfilamente in in vitro Motilitätsassays.
Von Myosin aus Biopsie-Proben eines Patienten mit der Myosinkopfmutation Arg453Cys sowie eines Patienten mit der Mutation Arg719Trp wird die Gleitgeschwindigkeit fluoreszenzmarkierter Aktinfilamente im in vitro Motilitätsassay bestimmt. Hierzu wird Myosin aus einem Segment einer einzelnen Skelettmuskelfaser extrahiert und damit eine Glasoberfläche beschichtet, auf der dann ein in vitro Motilitätsassay durchgeführt wird. Die bisherigen Messungen der in vitro Gleitgeschwindigkeit zeigen keine signifikanten Abweichungen von Kontrollproben eines gesunden Patienten.
Mitarbeiter: Tim Scholz. Förderung: DFG
(3) Nachweis und Quantifizierung von Myosinmutanten bei familiärer hypertrophischer Kardiomyopathie.
In unserer Abteilung wurde eine Methode zur Quantifizierung von Punktmutationen auf Proteinebene entwickelt, die bereits zur Untersuchung einer bei der familiären hypertrophischen Kardiomyopathie (FHC) auftretenden Mutation in der ß-Isoform der schweren Kette des Myosins eingesetzt wurde. Diese Methode erlaubt einen möglichen Zusammenhang zwischen Mengenverhältnis von Wildtyp zu mutiertem Protein und dem Schweregrad der klinischen Symptomatik zu erkennen.
Inzwischen wurde diese Methode bei einer weiteren Mutation (ARG719TRY) erfolgreich angewendet. Zur Zeit wird darüberhinaus versucht, das Analyseverfahren für ein breiteres Anwendungsspektrum weiterzuentwickeln.
Um herauszufinden, auf welcher Stufe der Proteinbiosynthese bei heterozygoten Trägern die Abweichung von dem erwarteten 1:1 Verhältnis von Wildtyp zu mutiertem Protein stattfindet, wurde inzwischen begonnen, das Mengenverhältnis Wildtyp/Mutante auf mRNA-Ebene zu quantifizieren.
Mitarbeiter: Imke Schulz, Volker Nier.
Förderung: Proteinanalytik DFG; mRNA Analytik MHH-HILF
(4) Gewinnung von humanem Myosin aus Zellkulturen.
Zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen Struktur und biologischer Funktion einzelner Elemente des Myosinmoleküls soll die Funktion von Myosinmolekülen untersucht werden, die durch Punktmutationen gezielt verändert worden sind. Dies soll u.a. auch Rückschlüsse auf die funktionelle Auswirkung von Punktmutationen erlauben, die bei Patienten mit familiärer hypertrophischer Kardiomypoathie identifiziert wurden. Es wird versucht, die ß-kardiale Isoform der schweren Kette des Myosins in COS-1-Zellen zu exprimieren. Die Zellen und Plasmidvektoren stehen durch eine Kollaboration mit Prof. H.-P. Vosberg (MPI für Physiologische und Klinische Forschung, Bad Nauheim) zur Verfügung. In ersten Versuchen wurde eine geeignete Transfektionsmethode etabliert.
Mitarbeiter: Volker Nier.
Weitere Forschungsprojekte:
Projekte zu den Grundprinzipien der Muskelkontraktion/Zellmotilität und ihrer Regulation
(I) Experimente mit membranfreien Muskelfasern ("Skinned fibers")
Vergleichende röntgenstrukturanalytische Untersuchungen an einzelnen Skelettmuskelfasern während isometrischer Kontraktion sowie in Gegenwart von eindiffundierten Myosinkopf-Fragmenten.
Aufgrund der seit einigen Jahren bekannten Kristallstruktur des Myosinkopfes sowie des Aktins wurden in jüngster Zeit Hypothesen zu der Frage entwickelt, welche Strukturänderungen im Myosinkopf einer Kraftgenerierung oder Bewegung des Skelettmuskels zugrunde liegen könnten (K.C. Holmes, Curr. Biol. 1997). Im Widerspruch zu diesen Konzepten zeigten unsere 2D-röntgenstrukturanalytischen Untersuchungen der Aktinschichtlinien von einzelnen Skelettmuskelfasern während isometrischer Kontraktion, daß sich kraftgenerierende Querbrücken strukturell von Rigor-Querbrücken zu unterscheiden scheinen. So stellte sich die Frage, ob unter isometrischen Bedingungen nur ein kleinerer Teil des Myosinkopfes stereospezifisch mit Aktin assoziiert ist, während der Rest des Kopfes im Gegensatz zum Rigor ein Spektrum verschiedener Orientierungen einnimmt. Wir haben deshalb 2D-Röntgendiffraktionsbilder von Muskelfasern registriert, in die isolierte Myosinköpfe mit unterschiedlicher Struktur eindiffundiert worden waren. Die Bindung dieser Myosinköpfe an Aktinfilamente in den Fasern äußert sich in Änderungen der Aktinschichtlinien. Die beobachteten Änderungen scheinen zu bestätigen, daß die unterschiedliche Intensitätsverteilung auf den Aktinschichtlinien im Rigor bzw. unter isometrischer Kontraktion durch unterschiedliche Struktur der unter diesen Bedingungen angedockten Querbrücken zustande kommt.
Mitarbeiter: Thomas Mattei, Birgit Piep, Theresia Kraft, Ante Radocaj, Bernhard Brenner. Förderung: EU (Large Facility Programme).
Charakterisierung verschiedener Querbrücken-Zustände durch mechanische und röntgenstrukturanalytische Untersuchungen an einzelnen Skelettmuskelfasern: Querbrücken mit MgPyrophosphat und mit MgADP-Aluminium-Fluorid als Nukleotid-Analoga.
Um die molekularen Mechanismen, die der Muskelkontraktion zugrunde liegen, verstehen zu können, ist die Kenntnis der strukturellen und mechanischen Eigenschaften der am Aktinfilament angehefteten Querbrücken erforderlich. Während isotonischer Verkürzung sowie bei isometrischer Kraftentwicklung des Muskels durchläuft jede Querbrücke einen Zyklus von Zuständen hoher und geringer Aktinaffinität, die sich biochemisch, mechanisch und strukturell unterscheiden. Es besteht die Möglichkeit, einzelne dieser Zustände durch Verwendung von nicht-hydrolysierbaren Nukleotidanaloga zu simulieren und so genauer charakterisieren zu können.
Wir haben Querbrücken mit MgADP-AlF4, einem Analgon für einen Zustand geringer Aktinaffinität, welcher der Kraftgenerierung unmittelbar voraus gehen soll (Fisher et al., Biophys. J. und Biochemistry, 1995), sowie mit MgPPi als Beispiel für einen Zustand mit hoher Aktinaffinität untersucht. An einzelnen Skelettmuskelfasern wurden in Gegenwart dieser Analoga mechanische Messungen der Fasersteifheit durchgeführt und 2D-Röntgendiffraktionsbilder registriert. Durch Modellrechnungen soll nun geklärt werden, welcher Zustand im Querbrückenzyklus dem MgADP-AlF4 bzw. dem MgPPi Zustand am ehesten entspricht und welche Strukturänderungen am Übergang zwischen beiden Zustandsgruppen sich aus unseren Röntgenspektren ergeben.
Mitarbeiter: Christoph Nocula, Birgit Piep, Thomas Mattei, Theresia Kraft, Bernhard Brenner.
Regulation der Muskelkontraktion auf Molekularer Ebene
Ziel dieses Projektes ist herauszufinden, wie die Calzium-induzierte Umlagerung der Regulatorproteine Troponin und Tropomyosin die Muskelaktivität auf molekularer Ebene reguliert. Dazu werden in skinned fibers natives Troponin gegen extern appliziertes fluoreszenzmarkiertes Troponin ausgetauscht. Der Austausch wird mittels konfokaler Lasermikroskopie verfolgt. Über Fluoreszensintensitätsänderungen können Umlagerungen der Regulatorproteine, einschließlich der Umlagerungskinetik verfolgt werden. Die bisherigen Beobachtungen bestätigen ein von uns entwickeltes Modell zur Kontrolle der Muskeltätigkeit auf Querbrückenebene.
Mitarbeiter: Bernhard Brenner, Theresia Kraft.
(II) In vitro Motilitätsassays
Ein wesentlicher Ansatz, die molekularen Grundprinzipien der Muskelkontraktion bzw. Zellmotilität und deren Regulation zu analysieren, ist der Einsatz gezielter Mutanten der beteiligten Proteine. Während durch den von uns entwickelten Austausch nativer Proteine gegen extern applizierte Moleküle Regulatorproteine und deren in Expressionssystemen (E. coli) produzierte Mutanten in skinned fibers integriert werden können, ist ein solcher Weg zur Integration von Myosin- oder Aktinmutanten in den kontraktilen Apparat von skinned fibers nicht gangbar. Um dennoch auch in geeigneten Expressionssystemen produzierte gezielte Mutanten von Myosin oder Aktin funktionell charakterisieren zu können, haben wir neben den skinned fiber Studien begonnen, auch in vitro Motilitätsassays in unserer Arbeitsgruppe zu etablieren. Diese erlauben, auch außerhalb des normalen kontraktilen Apparates die Wechselwirkung von Myosin mit Aktinfilamenten zu analyisieren. Schließlich erlauben diese Assays auch die funktionelle Charakterisierung nicht-muskulärer Myosine oder anderer Motormoleküle wie Kinesine oder Dyneine.
Die weitreichende Bedeutung dieses Ansatzes wird durch die Einrichtung eines Schwerpunktes "Molekulare Motoren" (Koordinator B. Brenner) im April 1998 durch den Senat der DFG unterstrichen. Die Begutachtung der Einzelanträge ist abgeschlossen, die Förderung soll im Frühjahr 1999 beginnen.
Evanescent Field Mikroskopie (TIRF) (Objektiv-Typ)
In einer Kollaboration mit Drs. K. Oiwa und H.Kojima (Kansai Research Center, Kobe, Japan) haben wir begonnen, ein Mikroskopsystem zu etablieren, das die Beobachtung einzelner fluoreszenzmarkierter Moleküle (z.B. ATP) erlaubt. Dazu wird die bei Epifluoreszenz-Illumination bei Objektiven mit höchster numerischer Apertur auftretende Totalreflexion von Randstrahlen ausgenutzt, um die Fluoreszenzanregung auf eine unmittelbar an das Deckglas grenzende nur ca. 100-150nm dicke Schicht zu begrenzen. Damit kann die Hintergrundsintensität soweit reduziert werden, daß z.B. einzelne fluoreszenzmarkierte ATP-Moleküle durch Immobilisierung bei Bindung an Myosinmoleküle verfolgt werden können.
Mitarbeiter: Bernhard Brenner, Hiroaki Kojima.
Förderung: DFG
Kraftmessungen mit AFM-Sensoren
Basierend auf kommerziellen Sensoren für "atomic force microscopy" haben wir ein System entwickelt, das erlaubt Kräfte in einer Größenordnung zu messen, die den von einzelnen Myosinmolekülen entwickelten aktiven Kräften entspricht. Wir versuchen derzeit, eine in der Literatur beschriebene Methode zu integrieren, die es ermöglicht, den von einem Diodenlaser auf den Sensor ausgeübten Lichtdruck zu kontrollieren, um damit die in wässriger Lösung auftretenden Brownschen Fluktuationen der Sensoren (große Amplitude, langsame Frequenz) zu unterdrücken. Ebenfalls in Zusammenarbeit mit Drs. K. Oiwa und H. Kojima sollen geeignete Sensoren selbst gefertigt werden, um die Geometrie der Sensoren der jeweiligen Fragestellung anpassen zu können.
Mitarbeiter: Bernhard Brenner, Hiroaki Kojima.
Gleitgeschwindigkeit fluoreszenzmarkierter Aktinfilamente auf rekonstituierten Myosinfilamenten im in vitro Motilitätsassay
Es wurden aus Einzelmuskelfaserextrakten von chemisch gehäuteten Skelettmuskelfasern Myosinfilamente mit Längen von bis zu 22 µm rekonstituiert. Diese konnten mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden und auf ihnen die Gleitgeschwindigkeiten von fluoreszenzmarkierten Aktinfilamenten im in vitro Motilitätsassay gemessen werden. Die Wanderungsgeschwindigkeiten der Aktinfilamente in Richtung des Zentrums der rekonstituierten Myosinfilamente waren deutlich höher als vom Zentrum der Filamente weg. So konnte bei den aus Einzelmuskelfaserextrakten rekonstituierten Myosinfilamenten die schon von nativen dicken Filamenten aus glatten Muskeln der Mollusken bekannte funktionelle Bipolarität in bezug auf die Wanderungsgeschwindigkeiten gezeigt werden. Gegenüber dem früher beschriebenen Standard-in vitro Motilitätsassay können mit dieser Methode Myosinmoleküle in Filamenten in einer physiologischeren Umgebung untersucht werden.
Mitarbeiter: Tim Scholz.
Förderung: DFG
Mikromechanische Eigenschaften einzelner Myosin Motorproteine im in vitro Motilitätsassay
Mitarbeiter: Edgar Meyhöfer, Christine Ruff.
Förderung: DFG
Mechanismus der Kraft- und Bewegungserzeugung durch Kinesinmoleküle
Mitarbeiter: Edgar Meyhöfer, Stefan Lakämper.
Förderung: Volkswagenstiftung
Untersuchungen über den Beitrag der glatten Muskulatur und des elastischen Systems zur Venenwandmechanik
Experimente an nativen und mit Elastase behandelten Abschnitten der menschlichen V.saphena magna zeigen, daß
1. bei tonisierten Venensegmenten im Dehnungsbereich maximaler Umfangsverkürzung die Bindegewebemechanik die Dehnungseigenschaften der Wand nicht beeinflussen;
2. im physiologischen Dehnungsbereich sich funktionell eine parallele Anordnung der glatten Muskulatur und der Bindegewebesysteme ergibt;
3. die Muskulatur mit steigenden Tonus einen überproportional wachsenden Teil der Wandbelastung trägt, was die Bedeutung der glatten Muskulatur bei der Entstehung primär variköser Venen unterstreicht.
Mitarbeiter: Udo Tutschke.
Originalpublikationen:
Brenner, B., Kraft, T., Chalovich, J.M.: Fluorescence of NBD-labeled troponin-I as a probe for the kinetics of thin filament activation. Adv. Exp. Med. Mol. Biol. 453, 152-162 (1998).
Kraft, T., Mattei, T., Brenner, B.: Structural features of force-generating cross-bridges: A 2D-X-ray diffraction study. Adv. Exp. Med. Mol. Biol. 453, 279-285 (1998).
Stolz, M., Kraft, T., Wallimann, T.: The isoenzyme-diagnostic regions of muscle-type creatine kinase, the M-260 and M-300 box. are not responsible for its binding to the myofibrillar M-band. Eur. J. Cell Biol. 77, 1-9 (1998).
Wallimann, T., Dolder, M., Schlattner, U., Eder, M., Hornemann, T., Kraft, T., Stolz, M.: Creatine kinase: An enzyme with a central role in cellular energy metabolism. Magentic Resonance Materials in Physics, Biology and Medicine 6, 116-119 (1998).
Xu, S., Malinchik, S., Frisbie, S., Gu, J., Kraft, T., Rapp, G., Chalovich, J.M., Brenner, B., Yu, L.C.: X-ray diffraction studies of the cross-bridge intermediate states. Adv. Exp. Med. Molec. Biol. 453, 271-278 (1998).
Buchbeiträge:
Brenner, B.: Muscle Mechanics II: skinned muscle fibers. In: Current Methods in Muscle Physiology, H. Sugi (ed.) Oxford University Press, pp 33-69 (1998).
Diplomarbeiten:
Dipl. Biol. T. Mattei: 2D-Röntgenstrukturanalytische Untersuchungen zur Konformation der kraftgenerierenden Querbrücken im Skelettmuskel des Kanninchens.
Dipl. Biochem. C. Nocula: Mechanische und röntgenstrukturanalytische Charakterisierung hochaffiner Aktomyosin-Wechselwirkungen in Gegenwart von Mg-Pyrophosphat als Nukleotidanalogon.
Dipl. Biochem. T. Scholz: Entwicklung modifizierter in vitro Motilitätsassays für das Aktomyosinsystem.
Dipl. Biol. H. U. Uphoff: Standardisierung eines in vitro Motilitäts-Assays (Gleitassay) zur Charakterisierung des Akto-Myosin-Systems verschiedener Muskeltypen.
Förderungen:
DFG:
Familiäre Hypertrophische Kardiomyopathie (FHC). Myosinmutationen und resultierende Funktionsstörungen auf molekularer Ebene. (Normalverfahren)
Regulation der Muskelkontraktion auf molekularer Ebene. (Normalverfahren)
Regulation mikrofilamentassoziierter Motilität. Charakterisierung über in vitro Motilitätsassays. (Forschergruppe Braunschweig/Göttingen/Hannover)
Mikromechanische Eigenschaften einzelner Myosinmotormoleküle im in vitro Motilitätssystem. (Schwerpunkt "Neue Mikroskopische Techniken in Biologie und Medizin").
EU (HCM-Programme):
Energy Transduction in Muscle- Molecular Correlations of Structure, Function and Mechanics.
Volkswagenstiftung:
Molekulare Nanotechnologie auf der Basis von einzelnen Kinesin Motormolekülen.